本试剂盒适用于克隆带有3'-末端A突出的PCR产物的克隆。本试剂盒提供的独特连接系统允许用户在1小时的时间里完成连接反应。

本公司的pUCm-T载体是为简化PCR产物的克隆而设计的。许多高温DNA聚合酶，如Taq DNA聚合酶、Tth DNA聚合酶等扩增的PCR产物在3'-末端后都带有一个突出的碱基A，这样的PCR产物可以用3'-末端后带有一个突出碱基T的载体方便地进行克隆。

pUCm-T是一种新颖的pUC系列T载体，其多克隆位点更多的单切点和β-半乳糖苷酶阅读框架的调整大大方便了克隆的蓝/白筛选。插入位点两端独特设计的两个PstI位点使插入片段可以用Pst I单酶切进行检测，也可以用非常廉价而高效的EcoR I和Hind III双酶切进行检测。可以用M13通用引物和T7启动子引物对PCR产物进行测序。pUCm-T含有T7 RNA聚合酶的启动子，可以对插入片段进行体外转录。

本说明结尾处列出了pUCm-T相关的技术资料，其全序列可参照pUC19（GenBank Accession Number M77789），只是其多克隆位点部分的序列有所不同。

• PCR产物3'末端带有突出的A碱基：Taq、Tth、AmpliTaq、KlenTaq DNA聚合酶扩增的PCR产物3'末端均带有突出的A碱基。建议扩增的PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳进行回收，再进行连接转化实验，可以使用百奥莱博产品柱式DNA胶回收试剂盒（货号：GS0049）。如果PCR扩增产物特异性很高，可直接使用百奥莱博产品柱式PCR产物纯化试剂盒（货号：GS0051）纯化PCR产物。
  
• PCR产物3’末端没有突出的A碱基：Pfu、Pwo、Tli或DeepVent等DNA聚合酶具有3'、5'外切酶活性，其扩增的PCR产物末端可能不带有3'A，要对这种平末端PCR产物进行克隆，应先对其进行3'末端加A，再进行连接转化实验。建议选用百奥莱博产品dA-Tailing Kit （货号：GS0124）进行加A实验。
  
• 自备试剂：SOC培养基、IPTG、X-gal等。

• 在0.2mL PCR管中配制下列连接体系（10μL体系）：
  
  

  成分	用量
  插入的目的片段	X μL（0.2pmol）
  pUCm-T Vector(50ng/μL)	1μL（50ng）
  10×Ligation Buffer	1μL
  50% PEG4000	1μL
  T4 DNA Ligase	1μL
  Sterilized ddH2O	至10μL

  
  注：一般最后加入T4 DNA Ligase。
  
• 16℃连接1~12h。
  注：为了达到最佳连接效果，建议16℃连接过夜。
  
• 将100μL感受态细胞置于冰上解冻后，加入上述10μL连接液，轻轻混匀，冰上放置30min。
  注：可选用一步法制备感受态细胞溶液（货号：GS0138）快速（5min）制备感受态细胞。
  
• 42℃水浴热激90sec，再冰上放置5min。
  
• 加入900μL SOC培养基，37℃振荡培养1h。
  
• 4000rpm离心3min，用枪头吸掉750μL上清液，用剩余的培养基将细胞悬浮。
  
• 将细菌悬液均匀涂布在含20μL IPTG（100mM）和100μL X-gal（20mg/mL）的氨苄青霉素抗性的LB平板上。
  注：涂布菌液的用量可以根据连接的效率及感受态细胞的转化效率而进行适当的调整。
  
• 将平板于37℃培养1h，然后倒置培养过夜。
  注：先将平板正向放置1小时，以吸收过多的液体。
  
• 用牙签挑取白色菌落，以M13通用引物或基因特异性引物进行PCR扩增，确认载体中插入片段的长度大小。或将白色菌落挑至含氨苄青霉素的液体培养基中37℃培养过夜，提取质粒后进行酶切鉴定。

• PCR产物的纯度
  
  • 连接反应前需用琼脂糖凝胶电泳检测PCR反应产物，如果电泳检测PCR产物条带弥散，或出现非特异条带，则需要切下目的条带，用胶回收试剂盒对目的片段进行回收。若PCR产物电泳检测只有预期大小的明显条带，也应使用PCR产物纯化试剂盒直接纯化PCR产物，以除去引物二聚体。不经纯化的PCR产物在某些条件下可直接用于连接，但由于引物二聚体和PCR产物中其它物质的影响，造成含有插入片段的阳性克隆数减少，因而需要筛选很多克隆方可得到含有目的PCR产物的阳性克隆。
• 平端PCR产物
  
  • 具有校正活性的热稳定性DNA聚合酶如Pfu、Pwo、Tli在进行PCR扩增时产生平端PCR产物。这种平端PCR产物可以进行3’末端加A尾后连接到pUCm-T载体中，采用这种方法进行连接，可大大提高克隆的效率。
• 优化插入片段和载体的摩尔比
  
  • pUCm-T载体优化的插入DNA片段和载体的摩尔比为3:1，采用3-10:1的连接比例也可成功进行连接。如果你的PCR产物开始连接的不理想，则有必要优化连接比例。
    
  • PCR产物的量可采用以下公式进行换算：
    PCR片段的量（ng）= [加入载体的量（ng）×插入片段大小（kb）/载体大小（kb）]×插入片段和载体的摩尔比
• 筛选含插入片段的转化子
  
  • 插入片段成功克隆到pUCm-T载体中，可阻断β半乳糖苷酶的编码序列，因而重组克隆可在指示培养基上通过颜色进行筛选。大多数情况下含有PCR产物的克隆菌为白色，如果PCR片段和LacZ基因在同一读码框内，即PCR片段碱基数是3的整数倍（含3’-A），并且读码框无终止密码子，则重组克隆菌可能为蓝色。

• 不切割pUCm-T载体的限制性内切酶
  

  AcaI	AccIII	AceII	Afa24RI	AgeI	AmaI	AosIII	ApaI	ApeI	AscI
  Asp78I	AtuCI	AvaIII	AvrII	BaeI	BalI	Bbf7411I	BbsI	BclI	Bco102II
  BfrBI	BlpI	BmgI	BplI	Bpu10I	Bpu1268I	BsaAI	BsaFI	BsaKI	BsaMI
  BscEI	BscJI	Bse59I	BseRI	BsgI	BsiWI	BsmFI	BsmGI	Bsp120I	Bsp87I
  BspGI	BspLU11III	BsrGI	BssHII	Bst1107I	Bst29I	Bst98I	BstEII	BstXI	Bsu36I
  CfrAI	CspI	Csp45I	DraIII	DrdII	EciAI	EciEI	Eco47III	Eco72I	EcoAI
  EcoBI	EcoDI	EcoDXXI	EcoDR3	EcoEI	EcoNI	EcoR124I	EcoR124II	EcoRD3	FinI
  FseI	HpaI	MluI	Mlu1106I	Mlu113I	Msp20I	MunI	NaeI	NgoMI	NheI
  NruI	NsiI	PacI	PauI	PfuI	PmeI	Ppu10I	Ppu6I	PpuMI	PshAI
  RleAI	SacII	SanDI	SfiI	SgfI	SgrAI	SmaI	SnaI	SnaBI	SpeI
  SrfI	Sse8647I	StuI	StySQ	SwaI	Uba1220I	Uba1221I	Uba1382I	UbaDI	Van91I
  XmaI

  
  
• 切割pUCm-T载体一次的限制性内切酶
  

  497_AacI	2708_AatII	517_AccI	408_Acc65I	503_AcrI
  515_Acs1371I	893_AflIII	2263_AflIV	503_AhyAI	1309_AlwNI
  186_ApaBI	396_ApoI	443_Apu16I	533_Asp52I	527_Asp5HI
  455_AteI	504_AvaI	498_BamHI	406_BanII	239_BbeI
  234_BbeAI	534_BbrI	2291_BcgI	2325_BcgI	492Bco63I
  492_BglII	1852_Bli49I	1847_BsaI	756_BsaXI	497_BsaBI
  117_BsbI	449_BshLI	462_BsoDI	401_Bsp117I	407_BspJ106I
  893_ BspLU11I	529_BspMI	455_Bst224I	1866_Cfr10I	515_ChuII
  445_ClaI	456_DsaI	515_DsaVI	401_Ecl137I	1786_EclHKI
  463_Eco52I	39_ 5Eco82I	397_EcoDR2	404_EcoICRI	2443_EcoKI
  2762_EcoO109I	396_EcoRI	452_EcoRV	541_EcoprrI	237_EheI
  50_Esp16I	45_Esp3 I	474_FsuI	518_HincII	534_HindIII
  235_KasI	412_KpnI	236_NarI	456_NcoI	508_Nli387/7I
  463_NotI	1801_Pfl1108I	2703_Ppu1253I	276_ 5PssI	406_SacI
  516_SalI	777_SapI	2266_ScaI	506_SciI	476_SexAI
  532_SphI	526_Sse8387I	2590_SspI	456_StyI	158_StySJ
  2443_Sty SPI	2380_SynII	478_Tth111I	1490_Tth111II	2760_Uba1326
  510_XbaI	484_XcmI	504_XhoI	2385_XmnI

  
  注：在多克隆位点上游255bp处存在第二个NdeI位点

• 转化后无
  

  可能的原因	建议
  转化过程有问题或感受态细胞失活	可通过转化pUC18/19等未切割的可用于抗性筛选的质粒，检测感受态细胞的转化效率和转化操作是否正确
  转化的宿主不正确	本制品的载体来源于pUC19载体，因此，适合于pUC19载体的感受态细胞都可使用，如JM109等。
  板上的抗生素浓度过高

  
  
• 插入对照DNA片段的阳性率低
  

  可能的原因	建议
  10×快速连接缓冲	提供的T4连接酶缓冲液为十倍浓度，10μL反应体积加1μL T4连接酶缓冲液
  液稀释不当
  连接反应存在问题	连接缓冲液只有低的活性。10×快速连接缓冲液含有ATP，温度波动时ATP易降解。使用一次性分装的缓冲液，避免其反复冻溶。
  	用大约20ng DNA分子量标准（如Lambda DNA/Hind III分子量标准）建立一个连接反应以检测连接酶及缓冲液的活力
  T突出端丢失，引起载体平端连接，因而蓝色菌落数高于白色菌落数	避免核酸外切酶的引入，降解T突出端。只使用无外源核酸酶的T4连接酶，含有pUCm-T载体的溶液也也要减少反复冻溶的次数。
  目的片段不纯	纯化PCR产物，切胶回收的PCR片段最好，可以除去残存的引物，引物二聚体，非特异性扩增产物等杂质。
  PCR产物是大片段DNA	PCR产物是大片段时其两端在液体中与T载体两端接触的机会减少，连接效率下降。

  
  
• 采用插入对照DNA片段，连接转化时白色克隆菌数低于60％。
  

  可能的原因	建议
  10×快速连接缓冲液稀释不当	提供的T4连接酶缓冲液为十倍浓度，10μL反应体积加1μL T4连接酶缓冲液
  T突出端丢失，引起载体平端连接，因而蓝色菌落数高于白色菌落数。	避免核酸外切酶的引入，降解T突出端。只使用系统自己提供的T4连接酶，这种连接酶外切酶活力最低。
  连接温度太高	连接温度过高（>28℃）可使背景增加，使重组克隆菌减少。降低连接温度可以提高白斑率，一般以16℃为宜。

  
  
• PCR产物连接时白色菌落数很少或根本没有。
  

  可能的原因	建议
  10×快速连接缓冲液稀释不当	提供的T4连接酶缓冲液为十倍浓度，10μL反应体积加1μL T4连接酶缓冲液。
  连接孵育时间不够长	连接过夜可得到理想结果。
  PCR产物中含有抑制连接的成分，导致连接的失败	将PCR产物和连接反应对照混合，观察是否存在抑制效应。如怀疑有抑制成分存在，应重新纯化PCR产物。
  PCR产物没有3’-A突出端，不能连接。	并非所有DNA聚合酶都产生3’-A突出端，如Pfu酶的PCR产物为平端。平端PCR产物可先通过聚合酶及dATP进行加尾反应产生3’-A突出端，再与T载体连接。
  由于紫外灯过度照射形成嘧啶二聚体，PCR产物不能连接。	请注意将PCR产物从胶中切出时，UV照射时间不能够过长，推荐使用 长波长的UV光源。
  PCR产物已经插入，但未破坏lacZ基因的翻译框。	造成lacZ基因的翻译框的移框突变
  插入片段：载体连接比例不理想	一般在一个反应体系中，需要连接的PCR产物分子数与T载体的分子数比例为3-10：1为适宜。
  连接的PCR片段中可能有引物二聚体	应重新纯化PCR产物。
  DNA重排	检测大量克隆观察重排是否是随机的。如果是随机重排，通过筛选可得到有目的DNA片段的克隆菌，而如果所有克隆是一种重排方式，则需要使用修补缺陷的菌株保护插入片段，减少重排事件的发生。

  
  
• PCR产物连接反应只产生白色克隆（没有蓝色克隆）
  

  可能的原因	建议
  氨苄失活，因而氨苄敏感菌可生长	检查氨苄平板是正常制备并在一个月内使用。
  菌株丧失F’因子	检测背景对照，如果菌落不是蓝色的，则可能是宿主菌细胞丢失F’因子（假设acIqZ.M15位于宿主菌的F’因子上，并使用正常平板）。用于T-载体系统的感受态细胞一定要正确制备。
  平板不适合蓝白斑筛选。	检测背景对照，如果克隆菌不是蓝色的，检查平板是否含有氨苄/IPTG/X-Gal以及是否新鲜。如平板有问题，重新制备新鲜平板。

  
  
• 含有目的PCR产物的克隆菌数不够。
  

  可能的原因	建议
  PCR片段很多没有A尾。	如果是具有3-5外切酶活性的酶PCR产物需要进行加尾反应。样品纯化后进行连接反应，如果酶是具有在3端附加A的功能，请确保PCR最后的72℃ 5～10分钟的伸长时间。
  插入片段：载体比例不理想。	凝胶电泳检测PCR产物的完整性及产量，优化插入片段与T载体分子数的比例。
  PCR产物的量不足	多次PCR扩增，用大梳子制胶回收.每个孔多加些PCR产物，进行回收。
  PCR片段A尾丢失	PCR结束后请立即使用或-20度保存，避免合温放置。