1．以每孔4×10³～1×10⁵细胞接种于96孔板中，进行您所需要的药物处理或者其他刺激处理。
2．准备一份2×的EdU工作液(组分A)：以完全培养基稀释10mM的储液至合适的工作浓度。建议您以10μM的初始工作浓度开始预实验。
3．预热2×的EdU工作液，加入等体积的培养基，使浓度变为1×(如：需要得到10μM的终浓度，应以新鲜培养基等体积加入到20μM的EdU工作液中。)
4．合适时间合适条件孵育细胞，EdU孵育细胞的时间可以直接用做测定细胞DNA合成的指标，时间点选择以及孵育时间的长度取决于细胞生长速率。通过短暂的EdU孵育进行的脉冲式标记细胞可以用于研究细胞周期动力学。

1．孵育完成后，去除培养基加入50μL 4%中性多聚甲醛至各个孔的玻片上，室温孵育15～30分钟后，去除固定液。
2．每孔加入50μL 2mg/mL的甘氨酸溶液，室温孵育5分钟，中和残留的固定液。
3．以每孔0.1mL 3% BSA in PBS的洗涤液洗涤细胞2次。
4．去除洗涤液，加入0.1mL 0.5% Triton X-100 in PBS到每个孔中，室温孵育20分钟。

1．准备1×Click-iT EdU反应缓冲液(组分C):转移10×组分C试剂以去离子水稀释10倍即可。
2．制备一份5×的Click-iT EdU反应添加物储液(组分E)：加0.3mL去离子水至含30mg的E组分试管中，混匀至全部溶解。使用后，剩余储液存放在≤-20℃，可保存一年，溶液一旦呈现棕色，则说明有效成分降解不能再用。
注意：不同规格的组分E均按照此比例加去离子水溶解为5×储液备用。
3．准备1×Click-iT EdU缓冲液添加物(见表格2)：以去离子水稀释5×储液至1×，溶液应新鲜配制，当天用完。
4．依据表2准备Click-iT反应混合物。表2要求添加的组分对于反应来说非常重要，否则反应无法有效进行。
表2．Click-iT反应混合物：

成分	以10个孔的样本数为例
1×Click-iT反应缓冲液(组分C)	860μL
CuSO4 (组分D)	40μL
bFluor555-azide (组分B)	3μL
1×反应缓冲液添加物(步骤C.3所准备)	100μL
总体积	1mL

5．去除促渗液，以每孔0.1mL的3%BSA in PBS的洗涤液洗涤2次，去除洗涤液。
6．加入0.1mL Click-iT反应混合物至每个孔，简短摇晃培养板以确保反应混合物可以均匀覆盖细胞。
7．室温避光孵育30min。
8．除去反应混合物，每孔以0.1mL 3%BSA in PBS洗涤2次，去除洗涤液。
对于核染色，可以进行DNA复染。如其他无特别要求，即可进行拍照分析。

1．以0.1mL PBS洗涤每孔1次，去掉洗涤液。
2．以PBS稀释Hoechst33342(组分F)储液1：2000至1×Hoechst33342溶液，终浓度为5μg/mL。
3．每孔加0.1mL 1×Hoechst33342溶液，室温避光孵育15～30min。除去Hoechst33342溶液。
4．0.1mL PBS洗涤每孔2次，去除洗涤液。