1．分子生物学实验级别的水（无核酸酶）。
2．待检测miRNA对应的qPCR上游引物（Forward primer）。

1．遵循引物设计的最普遍原则。
2．以成熟的miRNA序列为基础，将U替换成T，这是最基础和最简单的设计方法。
3．试剂盒中提供的下游引物的Tm值为65℃，设计上游引物的Tm值要尽量保证在65℃左右。
4．若按照原则2的方式直接设计的引物其Tm值过低，可以在引物的5’端添加几个碱基（最好为G或C碱基）；也可以在3’端添加1个或几个A碱基；或者5’端和3’端同时修饰。
5．若按照原则2的方式直接设计的引物其Tm值过高，可以在引物的5’或3’端去掉几个碱基。

1．使用前充分融解混匀。2×miRNA qPCR Mix短期使用可放在4℃，避免反复冻融。Reverse primer每次用完置-20℃保存。
2．miRNA第一链cDNA的加入量不要超过real time PCR体积1/10。
3．对于特殊的检测体系中，高含量的cDNA模板易导致非特异性扩增，根据所检测miRNA的丰度适当的稀释cDNA（10倍或者100倍）。
4．本品中含有荧光染料Sybr Green I，保存本品或配制PCR反应液时应避免强光照射。
5．2×miRNA qPCR Mix不含参比染料ROX，客户并根据qPCR仪器技术指导决定是否需要加ROX参比染料，用于消除信号本底以及校正孔与孔之间产生的荧光信号误差。
6．本试剂盒须与 miRNA荧光定量检测试剂盒（ALH189）配套使用。

1．在室温融化2 x miRNA qPCR Mix和Reverse primer（10μM）。
2．使用时请将2 x miRNA qPCR Mix上下颠倒轻轻均匀混合，避免起泡，并经轻微离心后使用。如果试剂没有混匀，其反应性能会有所下降。注：请不要使用振荡器混匀。
3．按照下表组分冰上进行反应液的配制。

成分	50μL体系	20μL体系	终浓度
2×miRNA qPCR Mix(With SYBR Green)	25μL	10μL	1×
10μM Forward primer	1μL	0.4μL	0.2μM
10μM Reverse primer	1μL	0.4μL	0.2μM
miRNA第一链cDNA	x μl	x μL	-
ddH2O	至50μL	至20μL	-

4．PCR程序设置
提高特异性选择两步法。提高扩增效率选择三步法。