本试剂盒向PCR体系中添加了荧光探针(TaqMan或Molecular Beacon等),在扩增过程中,荧光量与扩增产物量成正比,因此可通过荧光量来测定样品核酸量。本制品以RNA为模板反转录合成cDNA第一链,然后再以合成的cDNA为模板,继续用基因特异性引物扩增,并用荧光探针进行检测。在同一反应体系中可完成从反转录到qPCR的全部过程。
本试剂盒采用的酶是HotStart Taq,并结合了特别的缓冲液体系,能有效抑制非特异性反应,在更广的范围内对核酸含量进行准确定量。
产品组成:| 组分 | 规格 |
| 2×BalbScript Probe One-Step qRT-PCR UltraMix | 1mL |
| BalbScript RT Enzyme Mix | 100μL |
| RNase-Free Water | 2×1mL |
| ROX Reference Dye I | 200μL |
| ROX Reference Dye II | 200μL |
保存:-20℃
产品特点: 高特异性:采用特殊工艺制造的热启动HotStart Taq DNA聚合酶,大大提高了PCR扩增的特异性。
高效:百奥莱博精心配制的RealTime PCR专用试剂,具有更高扩增效率和灵敏度。
使用建议: 请将体系上下颠倒混匀,动作轻柔,避免起泡,并经轻微离心后使用。反应液的配制、分装请使用新的(无污染的)枪头及Microtube等,尽量避免污染。
参考染料:● 用ROX Reference Dye I校准的Real Time PCR仪有:
Applied Biosystems 5700/7000/7300/7700/7900/7900 HT/7900 HT Fast;Applied Biosystems StepOne/StepOne Plus;其他仪器。
● 用ROX Reference Dye II校准的Real Time PCR仪有:
Applied Biosystems 7500/7500 Fast;Stratagene MX4000/MX3500P/MX3000P;其他仪器。
● 不需要用ROX Reference Dye校准的Real Time PCR仪有:
Bio-Rad CFX96/CFX 384/iCycler iQ5/iQ/My iQ5/MiniOpticon/Opticon/Opticon/Chromo4;Eppendorf MasterCycler realplex/realplex 2s。Cepheid SmartCycler;Illumina Eco qPCR;R℃he Applied Science LightCycler 480;Thermo Scientific PikoReal Cycler;Qiagen/Corbett Rotor-Gene Q/Rotor-Gene 3000/Rotor-Gene 6000;其他仪器。
使用方法: 一、常用反应体系(20μL):| 成分 | 用量 |
| 2×BalbScript Probe One-Step qRT-PCR UltraMix | 10μL |
| BalbScriptR RT Enzyme Mix | 1μL |
| 上游引物 | 0.2~1.0μM(终浓度) |
| 下游引物 | 0.2~1.0μM(终浓度) |
| 探针10μM | 0.4μL |
| 模板 | 1pg~1μg |
| RNase-Free Water | 至20μL |
二、常用PCR循环:A.两步法扩增程序(推荐):
| 温度 | 时间 | 循环数 |
| 42℃ | 30min | 1 |
| 94℃ | 5min | 1 |
| 95℃ | 15s | 35~40 |
| 60℃ | 1min |
B.三步法PCR扩增程序(引物Tm值较低或其他原因):
| 温度 | 时间 | 循环数 |
| 42℃ | 30min | 1 |
| 94℃ | 5min | 1 |
| 95℃ | 15s | 35~40 |
| 57℃ | 20s |
| 72℃ | 30s |