a．取1～2μg载体酶切过夜，或至少酶切3～5小时以上。尽量确保酶切充分，否则后续会导致产生很多自连的克隆。
b．载体酶切完毕后，可以使用试剂盒进行纯化，例如百奥莱博的PCR产物DNA纯化试剂盒(货号：
YT009)。也可以采用常规的酚氯仿抽提乙醇沉淀方法纯化载体。对于酶切产生较大片段(大于50～60bp)的情况推荐采用切胶回收的方式。
c．对于PCR产物：PCR产物凝胶电泳后，切胶回收预期大小的DNA片段。凝胶中DNA片段的回收可以使用试剂盒进行操作，例如百奥莱博的琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(货号：
YT010)。也可以采用反复冻融等方法回收DNA片段。
d．对于回收的PCR产物或其它需酶切的质粒或DNA片段，用适当内切酶酶切，随后纯化酶切产物。
注：这一步的酶切不必酶切特别充分，通常酶切效率能达到80～90%以上即可。即本步骤的酶切通常酶切1～2小时即可。酶切产物可以使用试剂盒进行纯化，例如百奥莱博的PCR产物DNA纯化试剂盒。也可以采用常规的酚氯仿抽提乙醇沉淀方法纯化载体。
e．取约25～100ng经过酶切和纯化的载体，加入3倍摩尔数的待插入片段。参考下表设置连接反应体系。
注：很多时候由于载体量和待插入片段的量都比较少，在回收后很难定量。此时可以根据回收前电泳条带的亮度进行大致的估计。通常以DNA分子量标准的某一条带为参考，估计或通过灰度半定量您的目的条带和该参考条带的亮度的比例关系。然后再按照预计的纯化或凝胶回收时的得率计算出最终得到的载体量和待插入片段量的比例关系。
| 载体 | 约25～50ng | 约50～100ng |
| 待插入片段 | 约载体摩尔数的3倍 | 约载体摩尔数的3倍 |
| 2×快速连接缓冲液 | 5μL | 10μL |
| 双蒸水或Milli-Q水 | 至9.5μL | 至19μL |
| Rapid T4 DNA ligase | 0.5μL | 1μL |
| 总体积 | 10μL | 20μL |
f．用移液器轻轻吹打混匀或轻微Vortex混匀，室温离心数秒，使液体积聚于管底。
g．室温(25℃)孵育连接5～10分钟或更长时间。对于双平端连接需室温(25℃)孵育15～30分钟或更长时间。
注1：对于双粘端连接：室温孵育5～10分钟通常可以达到孵育更长时间所能达到最佳连接效率的70%以上。室温孵育30分钟和16℃孵育过夜相比，无显著差异。连接5～10分钟后，如果转化等后续步骤还没有准备好，完全可以适当延长连接时间。但通常不宜超过60分钟。如果可能超过60分钟，可以在4℃或16℃放置较长时间甚至过夜。
注2：对于双平端连接：室温孵育15分钟通常可以达到孵育更长时间所能达到最佳连接效率的70%以上。室温孵育60分钟和16℃孵育过夜相比，无显著差异。连接15分钟后，如果转化等后续步骤还没有准备好，完全可以适当延长连接时间。但通常不宜超过60分钟。如果可能超过60分钟，可以在4℃或16℃放置较长时间甚至过夜。
注3：上述室温连接效率的数据在25℃时获得，在20～27℃时获得的连接效率比较接近。室温较低或较高时推荐在25℃水浴进行连接。
h．随后即可直接取连接产物用于转化感受态细菌。
a．PCR产物凝胶电泳后，切胶回收预期大小的DNA片段。凝胶中DNA片段的回收可以使用试剂盒进行操作，例如百奥莱博的琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(货号：
YT010)。也可以采用反复冻融等方法回收DNA片段。
b．按照T载体的说明书取适量T载体，加入3倍摩尔数的待插入片段。参考下表设置连接反应体系。
注：很多时候由于载体量和PCR产物的量都比较少，在回收后很难定量。此时可以根据回收前电泳条带的亮度进行大致的估计。通常以DNA分子量标准的某一条带为参考，估计或通过灰度半定量您的目的条带和该参考条带的亮度的比例关系。然后再按照预计的纯化或凝胶回收时的得率计算出最终得到的载体量和PCR产物的量的比例关系。
| T载体 | 适量 | 适量 |
| 待插入片段 | 约载体摩尔数的3倍 | 约载体摩尔数的3倍 |
| 2×快速连接缓冲液 | 5μL | 10μL |
| 双蒸水或Milli-Q水 | 至9.5μL | 至19μL |
| Rapid T4 DNA ligase | 0.5μL | 1μL |
| 总体积 | 10μL | 20μL |
c．用移液器轻轻吹打混匀或轻微Vortex混匀，室温离心数秒，使液体积聚于管底。
d．室温孵育5～10分钟或更长时间。
注：室温孵育5～10分钟通常可以达到孵育更长时间所能达到最佳连接效率的70%以上。室温孵育30分钟和16℃孵育过夜相比，无显著差异。连接5～10分钟后，如果转化等后续步骤还没有准备好，完全可以适当延长室温的连接时间。但通常不宜超过60分钟。如果可能超过60分钟，可以在4℃或16℃放置较长时间甚至过夜。
e．随后即可直接取连接产物用于转化感受态细菌。
a．载体的酶切和纯化同步骤1a和1b。
b．Linker或RNAi片段的退火可以选择适当的DNA退火缓冲液，例如百奥莱博的DNA寡核苷酸退火缓冲液(货号：
YT483)，进行退火反应。
c．长度大于8bp的Linker或退火的RNAi片段，可以按照5:1至10:1的比例和载体进行连接反应。例如载体为0.03pmol，则插入片段可以为0.15至0.3pmol。长度小于8bp的linker，比例需调整为10:1以上。
d．除插入片段的用量外，随后按照步骤1e-1h进行。
