本产品是用于EMSA研究的一个试剂盒。通过EMSA可以研究目的蛋白和特定的DNA序列的结合情况，从而可以研究细胞内一些转录因子的激活水平。本试剂盒提供了进行EMSA实验的探针标记、蛋白和DNA结合以及EMSA上样等的主要试剂，使EMSA实验变得简单方便。

EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X)中含有poly(dI-dC)等有效成分。其中poly(dI-dC)的浓度经过优化，可以很好的消除蛋白和标记探针间的非特异性结合，同时又不会减弱目的转录因子和标记探针间的结合。

• 探针的标记：
  
  a．如下设置探针标记的反应体系：
  

  成分	用量
  待标记探针(1.75pmol/μl)	2μL
  T4 Polynucleotide Kinase Buffer(10X)	1μL
  Nuclease-Free Water	5μL
  [γ-32P]ATP(3,000Ci/mmol at 10mCi/ml)	1μL
  T4 Polynucleotide Kinase(5～10u/μl)	1μL
  总体积	10μL

  
  按照上述反应体系依次加入各种试剂，加入同位素后，Vortex混匀，再加入T4 Polynucleotide Kinase，混匀。
  b．使用水浴或PCR仪，37℃反应10分钟。
  c．加入1μL探针标记终止液，混匀，终止探针标记反应。
  d．再加入89μL TE，混匀。此时可以取少量探针用于检测标记的效率。通常标记的效率在30%以上，即总放射性的30%以上标记到了探针上。为实验简便起见，通常不必测定探针的标记效率。
  e．标记好的探针最好立即使用，最长使用时间一般不宜超过3天。标记好的探针可以保存在-20℃。
  
  
• 探针的纯化：
  通常为实验简便起见，可以不必纯化标记好的探针。在有些时候，纯化后的探针会改善EMSA的电泳结果。如需纯化，可以按照如下步骤操作：
  
  a．对于100μL标记好的探针，加入1/4体积即25μL的5M醋酸铵，再加入2体积即200μL的无水乙醇，混匀。
  b．在-70℃至-80℃沉淀1小时，或在-20℃沉淀过夜。
  c．在4℃，12000g～16000g离心30分钟。小心去除上清，切不可触及沉淀。
  d．在4℃，12000g～16000g离心1分钟。小心吸去残余液体。微晾干沉淀，但不宜过分干燥。
  e．加入100μL TE，完全溶解沉淀。标记好的探针最好立即使用，最长使用时间一般不宜超过3天。标记好的探针可以保存在-20℃。
  
  
• EMSA胶的配制：
  
  a．准备好倒胶的模具。可以使用常规的灌制蛋白电泳胶的模具，或其它适当的模具。最好选择可以灌制较薄胶的模具，以便于干胶等后续操作。为得到更好的结果，可以选择可灌制较大EMSA胶的模具。
  b．按照如下配方配制20mL 4％的聚丙烯酰胺凝胶。
  注意：使用29:1等不同比例的Acr/Bis对结果影响不大。
  

  成分	用量
  TBE buffer(10X)	1mL
  重蒸水	16.2mL
  39:1 acrylamide/bisacrylamide(40%,w/v)	2mL
  80%甘油	625μL
  10%过硫酸铵(ammonium persulfate)	150μL
  TEMED	10μL

  
  c．按照上述次序加入各个溶液，加入TEMED前先混匀，加入TEMED后立即混匀，并马上加入到制胶的模具中。避免产生气泡，并加上梳齿。如果发现非常容易形成气泡，可以把一块制胶的玻璃板进行硅烷化处理。
  
  
• EMSA结合反应：
  
  a．如下设置EMSA结合反应(预期的结果参见图1)：
  

  阴性对照反应：
  Nuclease-Free Water	7μL
  EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X)	2μL
  细胞核蛋白或纯化的转录因子	0μL
  标记好的探针	1μL
  总体积	10μL

  
  

  样品反应：
  Nuclease-Free Water	5μL
  EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X)	2μL
  细胞核蛋白或纯化的转录因子	2μL
  标记好的探针	1μL
  总体积	10μL

  
  

  探针冷竞争反应：
  Nuclease-Free Water	4μL
  EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X)	2μL
  细胞核蛋白或纯化的转录因子	2μL
  未标记的探针	1μL
  标记好的探针	1μL
  总体积	10μL

  
  

  突变探针的冷竞争反应：
  Nuclease-Free Water	4μL
  EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X)	2μL
  细胞核蛋白或纯化的转录因子	2μL
  未标记的突变探针	1μL
  标记好的探针	1μL
  总体积	10μL

  
  

  Super-shift反应：
  Nuclease-Free Water	4μL
  EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X)	2μL
  细胞核蛋白或纯化的转录因子	2μL
  目的蛋白特异抗体	1μL
  标记好的探针	1μL
  总体积	10μL

  
  b．按照上述顺序依次加入各种试剂，在加入标记好的探针前先混匀，并且室温（20～25℃）放置10分钟，从而消除可能发生的探针和蛋白的非特异性结合，或者让冷探针优先反应。然后加入标记好的探针，混匀，室温(20～25℃)放置20分钟。
  c．加入1μL EMSA/Gel-Shift上样缓冲液(无色，10X)，混匀后立即上样。
  注意：有些时候溴酚蓝会影响蛋白和DNA的结合，建议尽量使用无色的EMSA/Gel-Shift上样缓冲液。如果对于使用无色上样缓冲液在上样时感觉到无法上样，可以在无色上样缓冲液里面添加极少量的蓝色的上样缓冲液，至能观察到蓝颜色即可。
  
  
• 电泳分析：
  
  a．用0.5XTBE作为电泳液。按照10V/厘米的电压预电泳10分钟。预电泳的时候如果有空余的上样孔，可以加入少量稀释好的1X的EMSA上样缓冲液(蓝色)，以观察电压是否正常进行。
  b．把混合了上样缓冲液的样品加入到上样孔内。在多余的某个上样孔内加入10μL稀释好的1X的EMSA/Gel-Shift上样缓冲液(蓝色)，用于观察电泳进行的情况。
  c．按照10V/厘米的电压电泳。确保胶的温度不超过30℃，如果温度升高，需要适当降低电压。电泳至EMSA/Gel-Shift上样缓冲液中的蓝色染料溴酚蓝至胶的下缘1/4处，停止电泳。
  d．剪一片大小和EMSA胶大小相近或略大的比较厚实的滤纸。小心取下夹有EMSA胶的胶板，用吸水纸或普通草纸大致擦干胶板边缘的电压液。小心打开两块胶板中的上面一块(
  注：通常选择先移走硅烷化的那块玻璃板)，把滤纸从EMSA胶的一侧逐渐覆盖住整个EMSA胶，轻轻把滤纸和胶压紧。滤纸被胶微微浸湿后(大约不足1分钟)，轻轻揭起滤纸，这时EMSA胶会被滤纸一起揭起来。把滤纸侧向下，放平，在EMSA胶的上面覆盖一层保鲜膜，确保保鲜膜和胶之间没有气泡。
  e．在干胶仪器上干燥EMSA胶。然后用X光片压片检测，或用其它适当仪器设备检测。EMSA的典型分析结果可以参见下面的图1。
  
  图1．一个典型的EMSA/Gel-Shift分析图
  泳道1：阴性对照反应(标记探针)；
  泳道2：常规反应(含激活的目的转录因子的核蛋白＋标记探针)；
  泳道3：探针冷竞争反应(含激活的目的转录因子的核蛋白＋标记探针+标记探针100倍量的未标记探针)；
  泳道4：突变探针的冷竞争反应(含激活的目的转录因子的核蛋白＋标记探针+标记探针100倍量的未标记突变探针)；
  泳道5：Super-shift反应(含激活的目的转录因子的核蛋白＋标记探针+目的转录因子的特异抗体)。