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PCR产物T载体克隆试剂盒 产品官方链接

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百奥莱博
北京
2024-06-20 14:12
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北京百奥莱博科技有限公司

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北京百奥莱博科技有限公司
王欣
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570202610
北京百奥莱博科技有限公司
产品属性
货号GS2273
规格20次|100次
产品说明

本试剂盒适用于克隆带有3’末端A突出的的PCR产物。本试剂盒提供的独特连接系统允许用户在1～2小时内的时间里完成连接反应。


本公司的pUCm-T载体是为简化PCR产物的克隆而设计的。许多热稳定的DNA聚合酶，如Taq DNA聚合酶、Tth DNA聚合酶等扩增的PCR产物在3’末端后都带有一个突出的碱基A，这样的PCR产物很容易连接到带有突出碱基T的T载体上。


pUCm-T载体是一种新颖的pUC系列T载体，其多克隆位点大多是单切点，以及β-半乳糖苷酶读码框的调整，大大方便了克隆的蓝/白筛选。插入位点两端独特设计的两个PstI位点使插入片段可以用Pst I单酶切进行检测，也可以用非常廉价而高效的EcoR I和Hind III双酶切进行检测。可以用M13通用引物和T7启动子引物对PCR产物进行测序。pUCm-T含有T7 RNA聚合酶的启动子，可以对插入片段进行体外转录。


本说明书末列出了pUCm-T相关的技术资料，其全序列可参照pUC19(GenBank Accession Number M77789)，只是其多克隆位点部分的序列有所不同。



产品组成：
组分20T100T
pUCm-T vector1μg5μg
10×Ligation Buffer50μL200μL
50% PEG400050μL200μL
T4 DNA Ligase(5U/μL)100U500U
Sterilized ddH2O1mL1mL

保存：-20℃

使用方法：
A．连接反应的准备：

PCR产物是否需要纯化取决于扩增产物的质量。如果PCR产物特异性很高，则不需要对产物进行纯化。但是如果将质粒作为模板，则需要对PCR产物进行纯化，因为质粒模板在转化后会形成白色的菌落。PCR产物可通过琼脂糖凝胶电泳进行分离。本公司的PCR产物胶回收试剂盒(B610353)可有效回收>60bp的DNA片段。

Taq、Tth、AmpliTaq、KlenTaq DNA聚合酶扩增的PCR产物会在3’末端添加碱基A。Taq DNA聚合酶同具有3'→5'外切酶活性的Pfu、Pwo、Tli或Deep vent DNA聚合酶共同扩增的产物也可能会在3’末端添加碱基A。PCR产物3’端含有突出的碱基A可以被连接到pUCm-T上。具有3’?5’外切酶活性的DNA聚合酶扩增的PCR产物为平末端，克隆这样的片段需要在平末端加A。

B．连接反应：
1．在一个标准的10μL连接反应体系中，加入50ng (1μL) pUCm-T vector、0.2pmol PCR产物、1μL 10×ligation Buffer和1μL T4 DNA Ligase，并加入ddH2O至终体积为10μL，通常不需要对PCR产物进行定量。连接反应体系可根据如下进行配制：
成分用量
10×Ligation Buffer1μL
50%PEG1μL
pUCm-T vector1μL
纯化的PCR产物X μl
Sterilized waterY μl
T4 DNA Ligase1μL
总体积10μL
注：T4 DNA Ligase最后加。
2．16～23℃连接1h～过夜。
注：常规实验1h已足够。
C．转化：
1．将100μL感受态细胞冰上解冻，完全溶解后轻轻混匀。
2．加入5μL上述连接液，轻轻混匀，冰上放置30min。
3．42℃水浴热激1.5min。再在冰上放置2～10min。
4．加入400μL LB培养基，37℃ 200～250rpm振荡培养1h。
5．4000rpm离心5min，用枪头吸掉400μL上清液，用剩余的培养基将细胞重悬。
6．将细菌悬液均匀涂布在含有20μL IPTG(100mM)和100μL X-gal(20mg/mL)的氨苄青霉素抗性的LB平板上。
注：使用细菌的数量取决于连接和转化的效率。
7．将平板在37℃正向放置1小时后吸掉过多的液体，倒置培养过夜。
D．筛选
通过蓝/白斑筛选转化子
当外来DNA片段被克隆进pUCm-T时，LacZ基因读码框的编码序列被插入的外来DNA改变，因此a-序列的活性被影响，重组克隆可在X-gal/IPTG平板上通过颜色进行筛选，未发生重组克隆的菌落为蓝色。用牙签挑选IPTG/X-gal平板上的白色菌落，转移到含Amp+的液体培养基37℃过夜培养。
E．转化子的鉴定
1．从含白色菌落的液体培养基中提取质粒，用PstI或其它合适的限制性内切酶酶切质粒，检测插入片段的大小，以证明该菌落是否含有目的片段。
2．克隆的目的片段可使用M13通用引物或其它合适的引物进行测序，进一步证明该菌落含有目的片段。


附录参考：
1．pUCm-T载体图谱
pUCm-T载体
2．UCm-T载体启动子和多克隆位点序列
pUCm-T载体
3．pUCm-T载体的酶切位点
a．不切割pUCm-T载体的限制性内切酶
AcaIAccIIIAceIIAfa24RIAgeIAmaIAosIIIApaIApeIAscI
Asp78IAtuCIAvaIIIAvrIIBaeIBalIBbf7411IBbsIBclIBco102II
BfrBIBlpIBmgIBplIBpu10IBpu1268IBsaAIBsaFIBsaKIBsaMI
BscEIBscJIBse59IBseRIBsgIBsiWIBsmFIBsmGIBsp120IBsp87I
BspGIBspLU11IIIBsrGIBssHIIBst1107IBst29IBst98IBstEIIBstXIBsu36I
CfrAICspICsp45IDraIIIDrdIIEciAIEciEIEco47IIIEco72IEcoAI
EcoBIEcoDIEcoDXXIEcoDR3EcoEIEcoNIEcoR124IEcoR124IIEcoRD3FinI
FseIHpaIMluIMlu1106IMlu113IMsp20IMunINaeINgoMINheI
NruINsiIPacIPauIPfuIPmeIPpu10IPpu6IPpuMIPshAI
RleAISacIISanDISfiISgfISgrAISmaISnaISnaBISpeI
SrfISse8647IStuIStySQSwaIUba1220IUba1221IUba1382IUbaDIVan91I
XmaI
b．切割pUCm-T载体一次的限制性内切酶
AacI497AteI455BsbI117Eco52I463KasI235SphI532
AatII2708AvaI504BshLI449Eco82I395KpnI412Sse8387I526
AccI517BamHI498BsoDI462EcoDR2397NarI236SspI2590
Acc65I408BanII406Bsp117I401EcoICRI404NcoI456StyI456
AcrI503BbeI239BspJ106I407EcoKI2443Nli387/7I508StySJ158
Acs1371I515BbeAI234BspLU11I893EcoO109I2762NotI463StySPI2443
AflIII893BbrI534BspMI529EcoRI396Pfl1108I1801SynII2380
AflIV2263BcgI2291Bst224I455EcoRV452Ppu1253I2703Tth111I478
AhyAI503BcgI2325Cfr10I1866EcoprrI541PssI2765Tth111II1490
AlwNI1309Bco63I492ChuII515EheI237SacI406Uba13262760
ApaBI186BglII492ClaI445Esp16I50SalI516XbaI510
ApoI396Bli49I1852DsaI456Esp3I45SapI777XcmI484
Apu16I443BsaI1847DsaVI515FsuI474ScaI2266XhoI504
Asp52I533BsaXI756Ecl137I401HincII518SciI506XmnI2385
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