本试剂盒是在病毒RNA快速抽提基础上,结合吸附柱对RNA进一步纯化。获得的RNA纯度较高,OD260/OD280比值一般为2.0左右,可直接用于RT-PCR和荧光RT-PCR等后续实验。
1.样品处理:
a.对于液体病毒样品:在1.5mL离心管中加入0.1~0.2mL液体病毒样品。如果病毒需要富集,可以将1.5mL液体在4℃ 24000g冷冻离心60min,移弃1.3mL后剩下的0.2mL用于第2步处理。
b.对于拭子样品:将一个拭子放入离心管中,加入1mL自备的生理盐水,振荡器上充分振荡半分钟,然后转移0.2mL到1.5mL塑料离心管中,用于第2步处理。
2.加入0.6mL Buffer Rlysis-VG到第一步得到的0.2mL样品中,振荡30 s混匀后室温放置10min。
·Buffer Rlysis-VG在4℃放置后可能会产生沉淀,使用前必须放在65℃水浴使沉淀彻底溶解并充分摇匀后再取用。
3.加入0.6mL无水乙醇,盖上管盖并涡旋振荡15sec。
4.短暂离心后将700μL溶液转移到离心吸附柱中,室温放置2min。
5.12000rpm室温离心1min,弃穿透液,把吸附柱放回收集管中。
6.将剩余溶液短暂离心后全部转移到步骤4的离心吸附柱中,室温放置2min。
7.12000rpm室温离心1min,弃穿透液,把离心吸附柱放回收集管中。
8.加入500μL RPE Solution到离心吸附柱中,12000rpm室温离心1min,弃穿透液,把离心吸附柱放回收集管中。
9.重复第8步1次。
10.12000rpm室温离心2min,弃含穿透液的离心管。
11.将离心吸附柱套入到一个新的自备的RNase-free的1.5mL离心管中,在离心吸附柱的滤膜的中部加入30~100μL DEPC-treated ddH2O,然后室温放置2min。
12.12000rpm室温离心2min,收集管中的样品即为病毒RNA。
·RNA样品可以直接用于RT-PCR或逆转录反应,也可放-80℃长期保存。