本试剂盒基于CytoCalcein Green和PI双染法检测细胞活力，CytoCalcein Green是一种疏水性复合物，可以轻易地渗透进入完整的活细胞，通过酯酶的水解作用，产生强烈的荧光。通过细胞内酯酶水解非荧光性CytoCalcein Green，形成具有强烈荧光的亲水性Calcein，并且保留在细胞质中。这种酯酶的活性与活细胞数量成比例关系。DNA结合染料极性非常大，不能渗透进入具有完整细胞膜的活细胞，它只有在与死细胞的DNA结合的情况下才发出荧光。生长在培养板中的细胞可以被染料，且在不到两小时内就可以完成定量分析。本检测法比其它活细胞检测法更加强大、稳定。它可以用于许多荧光实验平台的高通量分析中，例如微孔板分析，免疫组化和流式细胞术。本试剂盒提供所有必需组分和最佳检测方案。它适合于增殖型和非增殖型细胞，也可用于悬浮和贴壁细胞。
1．在侧壁暗色底部透亮的多孔细胞板中，细胞计数，每孔铺100到10000个细胞，每个细胞孔中加入待测的化合物，在细胞培养箱中，孵育所需要的时间（比如24，48，或96个小时）。对于空白对照孔（不含细胞的培养基），加入等量的待测物缓冲液。对于96孔，建议细胞培养板每孔总体积为100μL，384细胞微量板，建议细胞培养板每孔总体积为25μL。
·细胞培养板中每株细胞的最佳浓度，是基于实验目的检测细胞增殖或是检测细胞毒性的不同，对于细胞增殖检测，每孔细胞浓度要尽量低，对于细胞毒性检测，每孔细胞初始浓度要尽量高。
2．加20μL DMSO (组分C)至一支CytoCalcein Green(组分A)中，充分混匀。
·20μL的CytoCalcein Green储备液量足够一个板使用，未用的CytoCalcein Green染料储存液储存于密闭的管子里，低于-20℃冷冻，避光，可保存一个月，期间应避免反复冻融。
3．将CytoCalcein Green储备液20μL和碘化丙锭（组分B）20μL加入至10mL的检测缓冲液（组份D），混匀，此染色工作液室温下至少能稳定保存2小时。
·如果细胞如CHO细胞中含有的有机阴离子转运蛋白，该蛋白随时间的延长可促进荧光染料渗漏，需要在加样缓冲液中加入丙磺舒储备溶液，丙磺舒工作浓度范围为1?2.5mM。未使用的丙磺舒储备溶液需要分装并冻存于温度低于-20℃的冰箱。由于最佳的染色条件可能因不同的细胞类型而有所不同，因此建议分别确定组分A和组分B的合适浓度。
4．根据需要（步骤1）用测试混合物处理细胞。
·加反应混合物之前不需要冲洗细胞。然而如果测试混合物对血清敏感，生长培养基和血清因子在加入测试混合物之前需要除去。吸取培养基后，每孔加入HHBS（含20mM Hepes的Hanks缓冲液），96孔板每孔加入100μL，384孔板每孔加入25μL，或者是使用无血清培养基培养细胞。
5．往96孔板每孔加入100μL染色工作液，384孔板每孔加入25μL染色工作液。
6．将染色反应板室温或37℃下避光孵育1小时。（孵育时间可以是15分钟到过夜，温育时间少于4小时我们得到了最佳结果）。
·适当的温育时间取决于所使用的细胞类型和细胞浓度。每个实验都需要进行温育时间优化。
·染色后不要洗细胞。
·对于非粘附细胞，孵育后建议将细胞板离心，800转2分钟，以中断反应。
7．对于活细胞，在波长490/525nm通过FITC滤光片监测荧光强度，对于死细胞在波长540/620nm通过四乙基若丹明异硫氰酸盐（TRITC）监测荧光强度。
用流式细胞仪对细胞活力进行测定：a．用测试化合物根据特定时间处理细胞；
b．离心收集细胞达到每管1～5×105个Centrifuge the cells to get 1～5×105 cells/tube；
c．用500μL CytoCalcein Green/PI染色溶液悬浮细胞；
d．在室温或37℃下进行孵育10至30分钟，避光。
选做：用HHBS缓冲液或自备缓冲液冲洗细胞，用500μL的HHBS缓冲液重悬细胞达到每管1～5×105个。
e．用流式细胞仪监测Ex/Em = 490/525nm～620nm处荧光强度（使用FL1和FL2通道）。
个细胞的细胞浓度分别通过0.5%皂素处理5分钟和未加皂素处理5分钟，然后离心细胞，吸去上清液，加入新鲜培养基。A为未经处理的细胞的100μL，B为50μL的未处理的和50μL的处理的细胞，C为75μL未经处理的细胞和25μL经处理的细胞，D为0.5%皂苷处理的细胞100μL，细胞铺于96孔黑色壁/透明底的多聚赖氨酸片板中。将细胞经CytoCalcein Green/PI染色溶液处理，每孔100μL，37℃孵育1小时。用BMG公司的NOVOstar测定波长为490/525nm和540/650nm的荧光强度。波长为490/525nm和540/650nm的荧光强度的比值即活细胞与死细胞的比值如图所示（n=6）
