细胞凋亡检测试剂盒 产品官方链接

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北京
2024-06-20 14:12

北京百奥莱博科技有限公司

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王欣
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北京百奥莱博科技有限公司
产品属性
货号KFS209
规格20T|50T|100T
产品说明
本试剂盒提供了一种简便、快速地提取染色质DNA的方法,并增加对小片段DNA的回收,从而增强了检测的敏感性。

背景资料:
细胞核染色质DNA断裂是细胞凋亡的标志特征。在细胞发生凋亡时,核酸内切酶被激活,选择性降解染色质DNA,形成50~300kb的大片段,并进而在核小体连接处断裂,形成180~200bp或其整倍数的DNA片段,这些DNA片段可从细胞中提取出来,通过琼脂糖凝胶电泳,溴化乙啶染色呈现为梯状条带(DNALadder),并据此判断细胞凋亡产生。

产品组成:
组分20T50T100T保存条件
Lysis Buffer1mL2.5mL5mL4℃
Enzyme A100μL250μL500μL-20℃
Enzyme B100μL250μL500μL-20℃
乙酸氨溶液800μL2mL4mL4℃
Loading Buffer100μL300μL500μL4℃

保存:-20℃,有效期1年。

自备器材:
高速离心机、微量移液器、涡旋振荡器、凝胶电泳仪、37~55℃水浴锅
冰乙醇、1.5m L Microtube、PBS、胰酶消化液、TE Buffer,琼脂糖,TBE、溴化乙啶、DNA Ladder Marker

注意事项:
1.DNA Ladder出现在细胞凋亡晚期,观察细胞形态已发生皱缩出芽,染色质完全凝聚,细胞核已固缩断裂的凋亡晚期形态,建议该种形态的凋亡细胞比例在30%以上时进行DNA Ladder检测或先进行Tunel检测.
2.DNA Ladder出现在一个较短的时间段,在凋亡早期取样,则无DNA降解的条带,而在凋亡末期取样则产生与细胞坏死相似的DNA弥散条芾。因此取样时间需根椐不同种类的细胞和诱导剂而摸索确定。
3.贴壁细胞最好不用胰酶消化而用细胞刮收集。
4.某些细胞不产生这种核小体间的DNA断裂,而是产生50~300kb的大片段断裂。


操作方法:
1.收集5×105细胞(2000r/min,4℃,离心5min)于1.5mL微量离心管中;
注意:不要使用过多的细胞,否则,随后的酶解可能不完全,会形成很粘稠的DNA溶液。
2.用PBS洗涤细胞二次(2000r/min,4度,离心5min),弃上清;
3.沉淀的细胞中每管加入50μL Lysis Buffer,用移液管尖混匀细胞沉淀。
注意:不要形成强烈的涡旋,否则,高分子量DNA可能会被剪切。以剪过的枪头插入液面下,打入空气轻轻吹动液体混匀。
4.再每管加入5μL Enzyme A溶液,轻弹管尖混匀,不要形成涡旋,37度孵育10~20min;
5.在上述溶液中每管加入5μL Enzyme B溶液,轻弹管尖混匀后,50度孵育30min或至溶液澄清为止;
6.加入40μL醋酸氨和200μL冷无水乙醇,混匀,置于-20℃,静置20~30min;
7.4℃,12000~14000rpm离心10min,小心地弃去上清,收集沉淀的DNA;
注:出现的DNA沉淀后,若无法用TE buffer溶剂溶解沉淀,可以进行以下操作:重复第4至5步(甚至可以考虑Enzyme B过夜消化),彻底消化蛋白,可以有效使DNA溶解。
8.加入0.5mL 70%的冷乙醇,洗DNA沉淀,再12000~14000rpm离心10min;
9.弃上清,DNA沉淀于室温干燥10min后,加入10~15μL TE Buffer,充分搅拌溶解DNA;
10.取上述10~15μL样品加入2~3μL Loading Buffer,1.5%琼脂糖凝胶电泳(凝胶和电泳缓冲液TBE均加入0.5μg/mL的溴化乙啶);
11.5 V/cm电泳1小时,紫外灯下观察并拍照。
注:电泳条件中5V/cm或2~4V/cm是电场强度的单位,具体实验时量一下正极与负极之间的距离,例如20cm,那么电泳需要的电压为距离×5V/cm=100V。
12.制备1.5%琼脂糖凝胶(也可以用1%),在上述孵育步骤结束后,每管加入5μL loading buffer混匀,干胶上样。13.低电压电泳至2/3处,(2~4V/cm,约4小时);
14.0.5μg/mL EB染液染色20分钟,紫外灯观察拍照。