叶绿体对温度高度敏感,所以整个操作必须在冰上或者在冷室进行,所用器皿和溶液均需要在4℃预冷。离心时一定要在4℃进行,离心力以g而不是rpm计算。如果需要研究叶绿体的功能,提取还需要在昏暗的光线条件下进行。
1.实验前1~2天将植物放在暗室培养以减少叶绿体中淀粉颗粒的形成,否则离心时这些颗粒很容易使叶绿体破裂。叶片在实验前需先用自来水洗净,再用蒸馏水淋洗,去掉多余水分。如果叶片采集后不能立即处理,则保存时需要保持叶片湿润,即使如此,叶片的放置时间也不能超过一天。
2.新鲜(实验当天)制备匀浆液:将自备的去离子水与匀浆液成分一按4:1的比例混合,然后在混合液中加入匀浆液成分二干粉到终浓度0.1%(每100mL中加入0.1g干粉),摇晃溶解后所得溶液即为匀浆液,冰上预冷待用。一次实验(从30g叶片提取叶绿体)所需要的匀浆液体积跟材料不同而不同。
3.新鲜采集植物叶片,快速去除叶脉并将叶片剪成1~3cm
2大小的碎片并浸泡在适量的预冷的匀浆液中(每克叶片加4mL匀浆液,但对烟草和大豆,每克叶片需要加6mL匀浆液)。
4.将浸泡了叶片的匀浆液转移到Waring匀浆机(即家用制备果汁的匀浆机)中,低速匀浆10秒,避免起泡沫。用玻璃棒把液面的碎片按入匀浆机底部后,再低速匀浆10秒。
注意:除Waring匀浆机外,还可以选择Dounce玻璃匀浆器,Polytron匀浆机和研磨(加玻璃珠)等裂解细胞的方法,但这些方法的单次处理量都比较小,需分成很多小份单独匀浆,然后再汇集。
5.用带柄尼龙滤膜过滤匀浆液,可先将滤液收集到预冷的200mL量筒中,再等分到4个预冷的50mL的塑料离心管中(每个管中的滤液不要超过35mL)。带柄尼龙滤膜后可反复使用。
6.在水平转子离心机上4℃ 200g离心3分钟(对菠菜,白菜和莴笋材料)或400g离心1分钟(对甜菜材料),白色沉淀为未破裂的细胞或细胞核。
7.将上清液(含叶绿体)转移到一个新的、预冷的50mL塑料离心管中。
8.在水平转子离心机上4℃ 1000g离心7分钟,小心弃上清,沉淀含叶绿体,呈浅绿色。
9.在沉淀中加入1.5mL预冷的匀浆液,手弹离心管底部使叶绿体重悬。
注意:
a.重悬时最好避免溶液起泡,也不要用枪头吹打,否则叶绿体容易破裂。
b.沉淀下有白色淀粉属于正常现象,但重悬叶绿体时避免将白色淀粉重悬。
10.将4管叶绿体重悬液汇集(共约6mL),得到叶绿体粗提液,可直接用于后续的SDS-PAGE,Western,ELISA和蛋白组分析。
11.如果需要以之为材料精提叶绿体,就需要用密度梯度离心法将完整的叶绿体和其他污染物进一步分离。具体操作步骤是:在50mL塑料离心管中先加入6mL匀浆液成分一和4mL Percoll,充分混合均匀。在其液面上小心铺上叶绿体粗提液。在水平转子离心机上4℃ 1000g离心8分钟,管底绿色沉淀为完整的叶绿体。小心将上清倒出后,用于叶绿体蛋白提取。