本制品对经典的SDS裂解液进行了改良,并使用高浓度的蛋白变性剂,大大提高了裂解的效率,缩短了裂解的时间。无需使用苯酚、氯仿等有毒试剂。从100mg新鲜大型真菌(如蘑菇)样品中可以获得1.5~5μg DNA,OD260/OD280比值一般为1.7~1.9。抽提得到的DNA可用于酶切、PCR、文库构建、Southern blot等相关实验。
1.该试剂盒中提供的Proteinase K溶液为特别优化的配方,方便使用,而且非常稳定,可以在室温保存半年以上而活性不受明显影响,如需进一步延长保存期限,请置4℃保存。
2.Buffer Digestion中含有刺激性的化合物,操作过程中应穿上实验服,戴好乳胶手套,避免沾染皮肤、眼睛和衣服,防止吸入口鼻。沾染皮肤或眼睛后,请立即用清水或生理盐水冲洗,必要时寻求医生的帮助。
1.取50~100mg新鲜大型真菌(如蘑菇)或20mg干燥的子实体或菌丝用液氮研磨成粉末,加入1.5mL离心管中。加入200μL Buffer Digestion和2μL β-巯基乙醇,再加入20μL Proteinase K溶液,震荡混匀。56℃水浴1h至细胞完全裂解。
·水浴过程中,每10min颠倒混匀一次,可促进样品裂解。
·如需得到无RNA的DNA,可在水浴后加入20μL的RNase A(10mg/mL),室温放置2~5min。
2.加入100μL Buffer PF,充分颠倒混匀,-20℃冰箱放置5min。
3.室温10000rpm离心5min,将上清转移到新的1.5mL离心管中。
4.加入200μL Buffer BD,充分颠倒混匀。
·加入Buffer BD后,如有沉淀产生,可70℃水浴10min。
5.加入200μL的无水乙醇,充分颠倒混匀。
·加入无水乙醇后可能会产生半透明纤维状悬浮物,不影响DNA的提取和应用。
6.将吸附柱放入收集管中,用移液器将溶液和半透明纤维状悬浮物全部加入吸附柱中,静置2min,再10000rpm室温离心1min,倒掉收集管中的废液。
7.将吸附柱放回收集管,加入500μL PW Solution,10000rpm离心30 s倒掉收集管中的废液。
·使用前注意溶液中是否按比例加入异丙醇。
8.将吸附柱放回收集管,加入500μL Wash Solution,10000rpm离心30 s倒掉收集管中的废液。
·使用前注意溶液中是否按比例加入无水乙醇。
9.将吸附柱重新放回收集管中,于12000rpm室温离心2min,离去残留的Wash Solution。
·将吸附柱打开盖子于室温放置数分钟,以彻底晾干吸附材料中残留的Wash Solution,Wash Solution的残留会影响基因组DNA的产量和后续的实验。
10.取出吸附柱,放入一个新的1.5mL离心管中,加入50μL TE Buffer静置3min,12000rpm室温离心2min,收集DNA溶液。提取的DNA可立即进行下一步实验或-20℃保存。
·如果想提高DNA的得率,可重复步骤10。