TUNEL 细胞凋亡原位检测试剂盒
一、试剂盒说明
TUNEL 细胞凋亡原位检测试剂盒说明书。在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸（PS）只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中的磷脂酰丝氨酸（PS）由脂膜内侧翻向外侧。Annexin V是一种分子量为35~36kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此Annexin V被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。将Annexin V进行荧光素FITC标记，以标记了的Annexin V作为荧光探针，利用荧光显微镜或流式细胞仪可检测细胞凋亡的发生。
碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但对凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核染红。因此将Annexin V与PI匹配使用，就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。
本试剂盒可应用于培养细胞凋亡检测（不推荐用于检测组织样本）。 
二、试剂盒组份

组份	(10 assays)	(20 assays)	(50 assays)	(100 assays)	储存条件
AnnexinV-FITC	50 μL	100 μL	250μL	500 μL	-20℃避光
Propidium Iodide	50 μL	100 μL	250μL	500 μL	4℃避光
Binding Buffer	5.0 mL	10.0 mL	25 mL	50 mL	4℃

注：1、Annexin V-FITC组份建议按需分装小份冻存于-20℃，避免反复冻融；
2、Propidium Iodide和Binding Buffer组份不用时可放置于4℃保存，Propidium Iodide需要避光。

三、试剂盒以外自备仪器和试剂
流式细胞仪或荧光显微镜、低速离心机、微量移液器
1.5m L Microtube、载玻片、盖玻片（荧光显微镜观察需用）、PBS、不含EDTA的胰酶消化液

四、使用注意事项

• 微量试剂取用前请离心集液。
• Annexin V-FITC，Propidium Iodide （PI）避光保存及使用。对于Annexin V-FITC这个组份，建议您在收到产品之后，分装为小份避光保存于-20℃，即用即取。
• Propidium Iodide（PI）有毒，操作时要戴手套。
• 本试剂盒适用于检测活细胞，流式细胞仪检测时，细胞数量不以应低于1×105，不推荐用于检测组织样本。
• 推荐使用悬浮培养细胞。如果是贴壁细胞，需用不含EDTA的胰酶消化，如消化不当，可能引起假阳性，而用细胞刮子会造成细胞粘连成团，而影响检测。可将胰酶消化后细胞的保存在含2%BSA的PBS中，防止进一步的损伤。
• 细胞固定后可能导致荧光的淬灭，请不要固定样品。
• 因检测细胞的类型、凋亡诱导剂种类、使用的检测仪器不同，因而流式检测的荧光补偿也不同，因此建议每次检测均需使用未经凋亡诱导处理的细胞作为对照，进行荧光补偿的调节。

五、 操作方法

• 悬浮细胞离心（2000rpm离心5min）收集；贴壁细胞用不含EDTA的胰酶消化收集（注：胰酶消化时间不易过长，否则容易引起假阳性）；
• 用PBS洗涤细胞二次（2000rpm离心5min）收集1~5×105细胞；
• 加入500μL的Binding Buffer悬浮细胞；
• 加入5μL Annexin V-FITC混匀后，加入5 μL Propidium Iodide，混匀；
• 室温、避光、反应5～15min；
• 请在1 hour内，进行下述荧光显微镜或流式细胞仪的观察和检测。

A．荧光显微镜观察

• 滴一滴上述染色后的细胞悬液于载玻片上，并用盖玻片盖上细胞；
• 对于贴壁细胞来说，也可直接用盖玻片来培养细胞并诱导细胞凋亡；

①　将细胞于盖玻片上生长，用适当的凋亡诱导剂诱导细胞凋亡，并设立阴性对照组；
②　用PBS洗涤细胞两次；
③　在500μL 的Binding Buffer中加入5μL Annexin V-FITC，5 μL Propidium Iodide，混匀；
④　将上述溶液滴加于盖玻片表面，使盖玻片表面均匀覆盖；
⑤　避光、室温反应5 min。
⑥　将盖玻片倒置于载玻片上，于荧光显微镜下、双色滤光片（FITC和罗丹明）观察。Annexin V-FITC荧光信号呈绿色，PI荧光信号呈红色。
B．流式细胞仪分析

• 用流式细胞仪检测，激发波长Ex=488 nm; 发射波长Em=530 nm。
• Annexin V-FITC的绿色荧光通过FITC通道（FL1）检测；PI红色荧光（流式Ex=488nm,Em≥630nm）通过FL2或FL3通道检测，建议使用FL3。
• 荧光补偿调节：使用经凋亡诱导处理的正常细胞，作为对照进行荧光补偿调节去除光谱重叠和设定十字门的位置。

六、 实验范例
用凋亡诱导剂诱导P388细胞凋亡，在37oC，5%CO2培养箱培养4～6h后，参照说明书的操作方法进行检测，经流式细胞仪检测结果见下图。

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