本试剂盒适用于从植物组织和植物干粉中提取总DNA,包括基因组DNA,线粒体DNA及叶绿体DNA。本制品可以处理多至100mg的样本,可纯化获得最大为50kb的DNA,多数片段在20~30kb之间。本试剂盒采用先进的硅胶膜技术和简单的离心程序,无需乙醇沉淀,简单快速地分离得到高纯度的DNA,有效去除PCR和其他酶促反应的抑制剂。本制品可以在1小时内完成总DNA的提取,纯化得到的DNA可以直接用于酶切、PCR、Real-Time PCR、文库构建、Southern Blot、分子标记等下游实验。
1.样品应避免反复冻融,否则会导致提取的DNA片段较小且提取量下降。
2.Buffer GP1在使用前请加入β-巯基乙醇,1mL Buffer GP1加1μL β-巯基乙醇。加入β巯基乙醇的Buffer GP1室温可保存1个月。
3.第一次使用前应按照试剂瓶标签的说明在Buffer GW1和Buffer GW2中加入无水乙醇。
4.使用前请检查Buffer GP1和Buffer GP2是否出现结晶或者沉淀,如有结晶或者沉淀,请将Buffer GP1和Buffer GP2于65℃水浴重新溶解。
5.如果下游实验对RNA污染比较敏感,可以在加入Buffer GP1孵育后,加入4μL DNase-Free的RNase A(100mg/mL),RNase A本试剂盒并未提供,如需要可单独向本公司订购
RNase A溶液(100mg/mL)(货号:WE0225)。
1.取植物新鲜组织约100mg或干重组织约20mg,加入液氮充分研磨。
2.将研磨后的粉末收集到离心管(自备)中,加入
700μL 65℃预热的Buffer GP1(使用前在预热的Buffer GP1中加入β-巯基乙醇,使其终浓度为0.1%),迅速颠倒混匀后,将离心管置于65℃水浴20分钟,水浴过程中颠倒离心管混匀样品数次。
注意:
如需去除RNA,可在上述步骤完成后,加入4μL浓度为100mg/mL的RNase A溶液(100mg/mL)(货号:WE0225),震荡混匀,室温放置5~10分钟。 3.加入
700μL氯仿,充分混匀,12000rpm(~13400×g)离心5分钟。
4.小心将上层水相转入一新的离心管(自备)中,加入
700μL Buffer GP2,充分混匀。
5.将步骤4中所得溶液全部加入到已装入收集管的吸附柱DM中。若一次不能加完溶液,可分多次转入。12000rpm离心1分钟,倒掉收集管中的废液,将吸附柱重新放回收集管中。
6.向吸附柱中加入
500μL Buffer GW1(使用前检查是否已加入无水乙醇),12000rpm离心1分钟,倒掉收集管中的废液,将吸附柱重新放回收集管中。
7.向吸附柱中加入
500μL Buffer GW2(使用前检查是否已加入无水乙醇),12000rpm离心1分钟,倒掉收集管中的废液,将吸附柱重新放回收集管中。
注意:如需进一步提高DNA纯度,可重复步骤7.
8.12000rpm离心2分钟,倒掉收集管中的废液。将吸附柱置于室温数分钟,以彻底晾干。
注意:
这一步的目的是将吸附柱中残余的乙醇去除,乙醇的残留会影响后续的酶促反应(酶切、PCR等)。 9.将吸附柱置于一个新的离心管(自备)中,向吸附柱的中间部位悬空加入50~100μL Buffer GE或灭菌水,室温放置2~5分钟,12000rpm离心1分钟,收集DNA溶液,-20℃保存DNA。
注意:
a.如果下游实验对pH值或EDTA敏感,可以用灭菌水洗脱。洗脱液的pH值对洗脱效率有很大影响,若用水做洗脱液应保证其pH值在7.0~8.5(可以用NaOH将水的pH值调到此范围),pH值低于7.0时洗脱效率不高。
b.离心之前室温孵育5分钟可以增加产量。
c.用另外的50~100μL Buffer GE或灭菌水再次洗脱可以增加产量。
d.如果要提高DNA的终浓度,可以将步骤9所得的DNA洗脱液重新加至吸附膜上,重复步骤9;若洗脱体积小于100μL,可以增加DNA的终浓度,但可能会减少总产量。如果DNA的量小于1μg,推荐用50μL Buffer GE或灭菌水洗脱。
e.因为保存在水中的DNA会受到酸性水解作用的影响,如需长期保存,推荐用Buffer GE洗脱并于-20℃保存。