Sephadex G-25葡聚糖层析介质是以环氧氯丙烷作为交联剂，通过醚键进行交联的葡聚糖珠状凝胶，是凝胶过滤层析中应用最广的也是用量最大的分离介质。葡聚糖凝胶工作原理是利用具有网状结构的葡聚糖凝胶分子筛作用，根据被分离物质不同分子大小进行分离筛选。大分子物质下移速度最快，最先洗脱下来，中分子物质次之，而小分子能够全部进入层析介质孔中，受到阻力最大，故最后被洗脱下来。Sephadex G-25葡聚糖层析介质分离范围为1～5kD(球形蛋白)，主要用于多肽的分离以及大分子蛋白质的脱盐和缓冲液替换。
1．溶胀
首次需将干胶颗粒进行溶胀。置于过量的去离子水中，室温下溶胀3h，或者90℃水浴1h。溶胀过程中严禁使用磁力搅拌，以免使微球破碎。
2．装柱：
a．根据待分离样品的性质配制初始缓冲液(平衡液)和洗脱缓冲液。如果是蛋白质等蛋白质的脱盐，一般推荐凝胶层析上样、平衡和洗脱只用一种低盐浓度的缓冲液。如中性附近的50mM Tris-盐酸、PBS缓冲液；如果是多肽的分离，可适当加入0.15M NaCl来屏蔽目标与凝胶的相互作用；如果是缓冲液置换，则根据需要选择目标缓冲液。
b．将所取凝胶抽干，用初始缓冲液(按凝胶:缓冲液= 3:1的比例)配成匀浆并脱气。
c．将层析柱垂直固定，底端用水或缓冲液润湿并保持一段液位。
d．用玻璃棒引导匀浆沿着柱内壁一次性倒入柱内，使凝胶在柱内自由沉降，水封层析柱，沉降过夜。
e．连结好柱子顶端活动柱头，打开蠕动泵，用操作流速让缓冲液流过5倍柱体积，再使用1.5倍的操作流速流过5倍柱体积，调节适配柱头，使其尽量贴近胶面，最后用2～3倍柱体积的缓冲液平衡柱子。
·所有操作过程不能引入气泡，保证凝胶的均匀度。
3．平衡：将平衡缓冲液以操作流速平衡层析柱，观察检测器的变化，直到电导、pH等参数不变。
4．上样：切换转换阀进行上样，上样量根据样品的性质和层析介质的量进行选择，一般而言，样品上样量不超过柱床体积的25%。样品用平衡液配制，用0.45μm微孔滤膜过滤进行预处理。
5．洗脱：切换到洗脱缓冲液进行恒定洗脱，经过出峰，至基线平衡。
6．再生：用0.2M NaOH或非离子洗涤剂洗2倍柱体积；接着去离子水冲洗3～5倍柱体积。
7．保存：使用完毕，将流动相替换为20%乙醇，并保存于4℃冰箱。
8．为了获得更好的除盐效果，建议不同粒径柱高保持在：粗颗粒在30cm及以上，中颗粒在20cm及以上，细颗粒在10cm及以上，超细颗粒在5cm及以上，颗粒粒径越小分辨率越高，流速越慢。
9．加样量的多少应根据实验而定，一般最大上样量不超过柱床体积的30%，以10～20%为最佳上样量。
10．本试剂只能够用于体外实验，不能够用于临床、治疗和动物体内实验等，由此产生的后果概不承担责任。
