本试剂盒采用独特的结合液/蛋白酶K迅速裂解细胞和灭活细胞内核酸酶,然后基因组DNA在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜,再通过一系列快速的漂洗-离心的步骤,抑制物去除液和漂洗液将细胞代谢物、蛋白等杂质去除,最后低盐的洗脱缓冲液将纯净基因组DNA从硅基质膜上洗脱。
1.切取不多于30mg的组织材料,放入装有180μL组织裂解液SL的1.5mL离心管中,涡旋振荡15秒。
·根据提取的组织不同,起始量也稍有不同,腮的细胞量较大,一般建议提取量不超过20mg。如果裂解困难,可先用液氮研磨。
2.加入20μL的蛋白酶K溶液(20mg/mL),立刻涡旋振荡充分混匀。将裂解物放置在55℃水浴1~3小时或者直到组织消化完全。
·不同组织裂解时间不同,通常需0.5~2小时即可完成。扇贝组织0.5小时基本可裂解完全,虾和鱼类组织1小时。每小时振荡混合样品2~3次,每次振荡混匀15秒。
·可选做步骤:如果RNA残留较多,需要去除RNA,可在完成步骤2后加20μL RNase A(20mg/mL)溶液,振荡混匀,室温放置5~10分钟。
3.加入200μL结合液CB,
立刻涡旋振荡充分混匀,70℃放置10分钟。
4.冷却后加100μL异丙醇,
充分颠倒或涡旋振荡充分混匀,此时可能出现絮状沉淀。
5.将上一步混合物和可能的沉淀都加入一个吸附柱AC中,(吸附柱放入收集管中)13000rpm离心60秒,倒掉收集管中的废液。
·如果有不溶组织物可能堵住枪头,可将枪头在吸水纸上轻蹭去除不溶物;如果吸上来的混合物少则可以将枪头和不溶物一起弃去,该做法是为了去除不溶物,以免堵塞离心柱。
·上述步骤中立刻涡旋或者吹打充分混匀非常重要,混匀不充分严重降低产量,必要时如样品粘稠不易混匀时可以涡旋振荡15秒混匀。
6.加入500μL抑制物去除液IR,12000rpm离心30秒,弃废液。
7.加入600μL漂洗液WB(请先检查是否已加入无水乙醇!),12000rpm离心30秒,弃掉废液。
8.加入600μL漂洗液WB,12000rpm离心30秒,弃掉废液。
9.将吸附柱AC放回空收集管中,13000rpm离心2分钟,尽量除去漂洗液,以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
10.取出吸附柱AC,放入一个干净的离心管中,在
吸附膜的中间部位加100μL洗脱缓冲液EB (洗脱缓冲液事先在65~70℃水浴中预热效果更好),室温放置3~5分钟,12000rpm离心1分钟。将得到的溶液重新加入离心吸附柱中,室温放置2分钟,12000rpm离心1分钟。
·洗脱体积越大,洗脱效率越高,如果需要DNA浓度较高,可以适当减少洗脱体积,但是最小体积不应少于50μL,体积过小降低DNA洗脱效率,减少DNA产量。
11.DNA可以存放在2~8℃,如果要长时间存放,可以放置在-20℃。