本试剂盒基于RNA合成过程中Uridine类似物EU的掺入，并通过随后的点击反应使EU被Alexa Fluor 488所标记，从而实现简单、快速、高灵敏地检测新合成RNA。本试剂盒可以检测到活细胞或组织样品中新合成的RNA，而不检测DNA。检测过程中不需要放射性同位素和抗体，只需要简单的两步反应即可完成。
经检测，有RNA合成的细胞在荧光显微镜下呈现较强的绿色荧光，可以用于荧光显微镜、激光共聚焦显微镜、流式细胞仪或荧光酶标仪检测，也可以用于高内涵筛选(HCS)。流式细胞仪或荧光酶标仪检测仅适用于细胞样品，不适用于组织切片。
EU (5-ethynyl-uridine)，中文名为5-炔基尿苷，是一种新型尿嘧啶核苷(Uridine)类似物，EU可以在RNA合成过程中替代尿苷掺入到新合成的RNA中。另一方面，EU上的乙炔基能与荧光标记的小分子叠氮化物探针(如Azide Alexa Fluor 488、Azide Alexa Fluor 555、Azide Alexa Fluor 594、Azide Alexa Fluor 647等)通过一价铜离子的催化发生共价反应，形成稳定的三唑环，该反应非常迅速高效，被称作点击反应(Click reaction)，其反应原理参见图1。通过点击反应，新合成的RNA会被相应的荧光探针所标记，从而可以使用适当的荧光检测设备检测到新合成RNA。
图1．本试剂盒中的点击反应(Click reaction)原理图。荧光探针等标记的叠氮化物(Labeled Azide)与掺入到细胞RNA中的EU，在铜离子的催化发生共价反应，形成稳定的三唑环，最终使细胞RNA标记上荧光探针或其它探针。
图2．本试剂盒检测测HeLa细胞新合成RNA的效果图。EU孵育2小时后检测，无EU组观察不到绿色荧光(最左侧一列)；EU (1mM)组有较强的绿色荧光(中间一列)；而用RNA合成抑制剂Actinomycin D (1μM)提前预处理0.5小时后，绿色荧光显著减弱，说明RNA合成抑制后，EU的掺入被显著抑制(最右侧一列)。实际检测效果会因实验条件、检测仪器等的不同而存在差异，图中效果仅供参考。
本试剂盒小包装如果用于培养的细胞(6孔板)的检测，可以检测50个样品，每个样品的反应体系为500μL的Click反应液；如果用于96孔板检测，可以检测500个样品，每个样品的检测体系为50μL的Click反应液；如果用于12孔、24孔、48孔或384孔板样品的检测，分别可以检测125、250、350和1250个样品，每个样品推荐的Click反应液用量为200μL、100μL、70μL和20μL；如果用于流式细胞仪检测，可以检测50个样品，每个细胞样品的细胞数量宜为10～100万，每个样品的反应体系为500μL的Click反应液；如果用于冰冻或石蜡切片的检测，可以检测125～250个样品，每个样品的反应体系为100～200μL的Click反应液。大包装可检测样品的数量为小包装的4倍。
1．Click Additive配制成溶液后请注意适当分装冻存。如果溶解后有白色物质析出，请上下颠倒多次，待全部溶解后使用。如果该溶液颜色变成棕色，说明该组分的有效成分已失效，请弃用。
2．如果用于动物实验需要更多EU，可以从百奥莱博订购
尿嘧啶核苷类似物5-EU(货号：YTB4611)。
3．由于本制品需要铜离子催化进行点击反应，请注意如下的兼容性问题及解决方案。本制品完全兼容有机类染料如Alexa Fluor系列普通染料及Fluorescein (FITC)、Allophycocyanin (APC)及APCE-tandems染料；对于Qdot纳米晶体探针、Horseradish peroxidase (HRP)、R-phycoerythrin (R-PE)和R-PE-tandems染料如Alexa Fluor 680-R-PE等，需要在点击反应完成后进行反应和检测；本制品会影响GFP、RFP、mCherry等荧光蛋白的荧光，对于荧光类蛋白如Green Fluorescent Protein (GFP)、TC-FlAsH和TC-ReAsH类试剂，需要在点击反应前进行反应和检测。由于Phalloidin (鬼笔环肽)不兼容点击反应，推荐使用
微管红色荧光探针(货号：YT179)进行细胞微管的检测。
1．
需要用户自己准备的耗材和试剂2．
检测体系的准备a．如下以6孔板或常规切片检测体系为例，如果使用12孔板、96孔板或384孔板等孔板，检测体系可以相应按比例缩小。
b．如果检测的是悬浮细胞，请按常规的悬浮细胞的操作方式进行。例如和贴壁细胞相比，相关步骤需要增加离心步骤等，如1000×g室温离心5分钟。
3．
培养细胞的EU标记及固定、洗涤和通透a．在6孔板中(如有必要可以加入盖玻片)培养适当数量的细胞。细胞培养过夜并且恢复到正常状态后，进行所需的药物处理或者其它刺激处理等。
b．配制2X的EU工作液：由于EU工作液是与培养液等体积加入到孔板中，所以需要配制成2X的工作液。推荐的EU终浓度为1mM (1X)，用细胞培养液50:1稀释EU (100mM)即可得到2X的EU工作液(2mM)，例如取100μL EU (100mM)加入4.9mL中，即得5mL 2X的EU工作液(2mM)。
注：对于A549、HeLa和NIH/3T3等贴壁细胞，推荐EU的使用终浓度为1mM。但细胞类型、培养液种类、细胞密度、细胞增殖速度等多方面的因素会影响EU掺入到细胞中的量，因此初次使用时建议对EU的使用浓度进行一定的摸索。如果之前使用过BrU进行实验，则可以参考BrU的终浓度作为EU的终浓度。
c．将37℃预热的2X的EU工作液(2mM)，等体积加入6孔板中，使6孔板中的EU终浓度变为1X。例如设计终浓度为1mM，原先6孔板中的培养液为1mL，则将1mL 2X的EU工作液(2mM)加入到孔板中。如果培养液体积过大，可以先吸除适量的培养液，再加入等体积的2X的EU工作液；或者可以减少EU工作液的体积并增加EU的浓度，使最终培养液中的EU浓度为1mM，例如2mL培养液中加入220μL 10mM EU。如果加药处理的，建议保持原来的药物浓度，直接添加适量EU在原培养孔中。
d．继续孵育细胞2小时。该孵育时间的长短取决于细胞生长速率，通常宜继续孵育细胞周期10%左右的时间。对于常见的哺乳动物细胞如HeLa、3T3、HEK293等，细胞周期大约在18～25小时，孵育时间宜在2小时左右。人胚胎细胞的细胞周期约30分钟，推荐的孵育时间为5分钟；酵母细胞的细胞周期约3小时，推荐的孵育时间为20分钟，增殖的神经细胞其细胞周期约5天，推荐的孵育时间为1天。孵育时间小于45分钟时，建议提高EU的浓度；孵育时间大于20小时时，建议适当降低EU的浓度。
e．EU标记细胞完成后，去除培养液，并加入1mL固定液，室温固定15分钟。
注：对于流式细胞仪检测，贴壁细胞胰酶消化后用培养液重悬后再固定。
f．去除固定液，每孔用1mL洗涤液洗涤细胞3次，每次3～5分钟。
g．去除洗涤液，每孔用1mL通透液，室温孵育10～15分钟。
h．去除通透液，每孔用1mL洗涤液洗涤细胞1～2次，每次3～5分钟。
i．转步骤5。
4．
动物体内EU的标记及切片样品的处理 EU可以通过注射或进食等适当方式进行动物的体内标记。如下以小鼠为例，其它动物体内EU的标记请参考相关文献。
a．对于小鼠，可以按照100～400mg/kg的用量，把EU用PBS配制成一定浓度，腹腔注射、特定组织或器官局部注射或者加入饮用水中。具体用量与所用动物的种类、体重以及使用方式有关，可以参考相关文献，因此初次使用时建议对EU的使用浓度进行一定的摸索，或者直接使用200mg/kg的浓度进行测试。如果之前使用过BrU进行实验，则可以参考BrU的终浓度作为EU的终浓度。EU可以单独购买百奥莱博的
YTB4611。
b．4小时后或根据特定实验确定的适当时间后，快速处死小鼠，取出所需的组织，按照常规步骤制作冰冻切片或石蜡切片。EU标记的时间也可以参考相关文献自行调整。
c．对于冰冻切片：
① 加入适量固定液，室温固定15分钟。
② 去除固定液，用适量洗涤液洗涤3次，每次3～5分钟。
③ 去除洗涤液，用适量通透液，室温孵育10～15分钟。
④ 去除通透液，用适量洗涤液洗涤1～2次，每次3～5分钟。
⑤ 抗原修复(选做)：如果同时需要进行目的蛋白的免疫荧光染色，并有必要进行抗原修复，可以使用适当的抗原修复液，例如
YT084冰冻切片快速抗原修复液(5X)，或者自行配制的适当的抗原修复液进行抗原修复处理。
⑥ 转步骤5。
d．对于石蜡切片：
① 脱蜡：二甲苯中脱蜡5～10分钟。换用新鲜的二甲苯，再脱蜡5～10分钟。无水乙醇5分钟，换新的无水乙醇3分钟。95%乙醇3分钟。85%乙醇3分钟。75%乙醇3分钟。50%乙醇3分钟。PBS 5分钟。
② 抗原修复(选做)：如果同时需要进行目的蛋白的免疫组化染色，可以使用适当的抗原修复液，例如
YT079柠檬酸钠抗原修复液(50X)、
YT080改进型柠檬酸钠抗原修复液(50X)、
YT081 EDTA抗原修复液(50X)、
YT082柠檬酸钠-EDTA抗原修复液(40X)、
YT083通用型强力抗原修复液(10X)、
YT085漂片抗原修复液(10X)，或者自行配制适当的抗原修复液进行抗原修复处理。
特别
注意：如果使用蛋白酶K或胰酶进行抗原修复，必须反复洗涤干净，否则残留的酶会严重干扰后续标记反应。
③ 转步骤5。
5．
EU检测 注：本步骤6孔板中每孔的反应体系为500μL的反应混合物。对于12、24、48、96和384孔板，每孔的反应的体系分别为200μL、100μL、70μL、50μL和20μL的反应混合物。对于较小的孔，单位培养面积的液体用量已经适当增加，以有效避免液体蒸发可能带来的负面影响。对于切片，可以根据切片大小，每个切片使用100～200μL的反应混合物。如下以6孔板中的细胞样品为例说明具体的操作方法，对于其它孔板或切片，仅每步溶液的用量按比例调整即可，其余方法相同。
a．配制Click Additive Solution：对于小包装，用1.3mL去离子水溶解试剂盒中提供的一管Click Additive，混匀至全部溶解，即为Click Additive Solution；对于大包装，加入10.4mL去离子水溶解试剂盒中提供的一瓶Click Additive，混匀至全部溶解，即为Click
Additive Solution。配制后可以适当分装，并-20℃保存。
b．参考下表配制Click反应液。
注：请严格按照下表中组分顺序和体积配制Click反应液，否则点击反应可能无法有效进行；Click反应液须在配制后15分钟内使用。
| Components | Wells of 6 well plates |
| 1 | 2 | 4 | 5 | 10 | 25 | 50 |
| Click Reaction Buffer | 430μL | 860μL | 1.72mL | 2.15mL | 4.3mL | 10.75mL | 21.5mL |
| CuSO4 | 20μL | 40μL | 80μL | 100μL | 200μL | 500μL | 1mL |
| Azide 488 | 1μL | 2μL | 4μL | 5μL | 10μL | 25μL | 50μL |
| Click Additive Solution | 50μL | 100μL | 200μL | 250μL | 500μL | 1.25mL | 2.5mL |
| Total volume | 500μL | 1mL | 2mL | 2.5mL | 5mL | 12.5mL | 25mL |
c．去除上一步骤中的洗涤液。
d．每孔加入0.5mL Click反应液，轻轻摇晃培养板以确保反应混合物可以均匀覆盖样品。
e．室温避光孵育30分钟。
f．吸除Click反应液，用洗涤液洗涤3次，每次3～5分钟。
g．如果需要对细胞核进行染色，可以参照步骤6进行。如无其它的特殊需要，即可在荧光显微镜下观察，或者使用流式细胞仪、多功能酶标仪进行荧光检测，或者用高内涵筛选仪器(一般高内涵筛选需要使用染料对细胞核进行染色)进行检测。Azide 488的最大激发波长是495nm，最大发射波长是519nm。
6．
细胞核染色 为了检测细胞增殖的比例，可以考虑使用Hoechst 33342进行细胞核染色。一般高内涵筛选仪器也需要对细胞核进行染色。
a．1X Hoechst 33342溶液的配制：按1:1000比例用PBS稀释Hoechst 33342 (1000X)，例如取1μL Hoechst 33342 (1000X)加入1mL PBS中，混匀，即得1mL 1X Hoechst 33342溶液。
b．接步骤5g，吸除洗涤液后，每孔加1X Hoechst 33342溶液1mL，室温避光孵育10分钟。
c．吸除1X Hoechst 33342溶液。
d．用洗涤液洗涤3次，每次3～5分钟。
e．随后即可进行荧光检测。Hoechst 33342为蓝色荧光，最大激发波长为346nm，最大发射波长为460nm。
7．
流式细胞仪检测 对于经步骤5或6获得的细胞悬液样品进行流式检测。如果使用传统的流体动力学聚焦的流式细胞仪来测量总RNA含量，请在检测过程中使用低流速，实验中的每个样品应使用相同的收集速率和细胞浓度。EU标记产生的荧光信号一般使用对数刻度的横坐标。Azide 488的最大激发波长是495nm，最大发射波长是519nm。
注1：建议使用未经EU标记的细胞样品作为流式细胞仪检测的阴性对照，并选择合适的电压。
注2：由于流式细胞仪检测比较灵敏，可根据细胞类型和实际染色情况对Azide 488的使用量进行适当调整。
