DNA片段化代表晚期细胞凋亡的特征。凋亡细胞中的DNA断裂可通过末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）介导的dUTP缺口末端标记（TUNEL）检测。TUNEL测定法依赖于DNA中存在的缺口，该缺口可通过TdT进行鉴定，TdT是一种酶，该酶催化添加标记物的dUTP的添加。现有的所有TUNEL分析均包含剧毒的椰油酸钠，这可能会诱导细胞凋亡并降低DNA产量和DNA链。本试剂盒使用了不含甲藻酸钠的专有缓冲系统，基于将我们独特的专有荧光染料掺入凋亡过程中形成的DNA片段中。该测定法经过优化，可在不使用抗体的情况下直接检测分离的或附着的细胞中的凋亡。本试剂盒为所有必需成分提供了优化的测定方案，适用于荧光酶标仪，荧光显微镜或流式细胞仪。
1．将0.5μL的100X Tunnelyte红色（组分A）添加到50μL反应缓冲液中（组分B）制成总体积为50.5μL的TUNEL工作溶液，避光保存。
2．应根据您的细胞系决定做细胞调亡实验的最佳细胞密度。96孔板培养的贴壁细胞我们建议细胞数量为每孔30,000到50,000个，96孔板培养的非贴壁细胞建议细胞密度为每孔1～2×10
6/mL。在每一个标记条件下，都要设置与诱导孔相同密度的未诱导细胞作为阴性对照孔。
3．固定和染色
a．吸出细胞培养基；
b．向每个样品中添加50μL TUNEL工作溶液，在37℃下孵育30～60分钟。
c．除去TUNEL工作溶液，并用200μL/孔的PBS洗涤细胞1～2次。
d．向每个样品中添加100μL反应缓冲液（组分B）；
e．使用荧光酶标仪在Ex/Em = 550/590～650nm（截止= 570nm），带有TRITC滤光片的荧光显微镜或带有FL3通道的流式细胞仪中监测荧光强度。
4．如需对细胞进行固定，请在e步骤之后，吸出反应缓冲液，每个孔加100μL/孔/96孔板的4％甲醛固定缓冲液。
注意：对于非贴壁细胞，添加需求量的4％甲醛固定缓冲液（如2×10
6细胞/mL）。
a．37℃孵育20至30分钟，去除固定剂。
b．用PBS洗涤细胞2～3次，并用100μL PBS/孔/96孔板替换。
c．使用荧光酶标仪在Ex/Em = 550/590～650nm（截止= 570nm），带有TRITC滤光片的荧光显微镜或带有FL3通道的流式细胞仪中监测荧光强度。
d．可选：在Ex/Em = 350/460nm处用1X Hoechst（组分C）对细胞核染色以进行图像分析。
图1．与未处理的对照相比，用100 nM或1μM星形孢菌素（SS）处理4小时的HeLa细胞中TUNEL反应的荧光图像。将细胞与TUNEL工作溶液在37℃下孵育1小时。使用带有TRITC滤光片组的荧光显微镜分析红色荧光信号。荧光标记的DNA链断裂在SS处理的细胞中显示出强烈的荧光染色。
