本产品是以探针法荧光定量PCR技术为基础开发的专门检测猪托克特诺病毒1型的试剂盒。
背景资料： 细环病毒是近年来发现的一种新型人畜共患DNA病毒，广泛存在于包括人类和家畜在内的多种哺乳动物中。目前我国猪群中TTV的流行病学报道较少。猪细环病毒1型(Torque Teno Sus Virus Type1，TTSuV-1)是新近发现的一种无囊膜的环状DNA病毒，衣壳蛋白是其主要结构蛋白，因此猪托克特诺病毒1型的快速准确鉴定对该病的预防和检疫有着重要作用。
产品特点：1．即开即用，用户只需要提供样品DNA模板。
2．引物和探针经过优化，灵敏性高。
3．提供阳性对照，便于区分假阴性样品。
4．特异性高，引物是根据猪托克特诺病毒1型通用高度保守区设计。
5．本产品足够50次20μL体系的探针法荧光定量PCR反应。
6．本产品只能用于科研。
产品组成：| 组分 | 规格 |
| 2×Probe qPCR MagicMix | 500μL |
| 荧光PCR专用模板稀释液 | 1mL |
| 猪托克特诺病毒1型探针法qPCR引物-探针混合液 | 150μL |
| 猪托克特诺病毒1型qPCR阳性对照(1×107拷贝/μL) | 50μL |
保存：-20℃，有效期一年。
使用方法： 一、稀释PCR阳性对照(以10
1～10
6拷贝/μL这6个10倍稀释度为例)
如果做定性实验，则此步可以跳过。如果做定量实验，则需要稀释阳性对照做标准曲线。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分。本产品只提供DNA片段作为阳性对照。
1．标记6个离心管，分别为6，5，4，3，2，1。
2．用带芯枪头分别加入45μL荧光PCR专用模板稀释液(最好用带芯枪头，下同)。
3．在6号管中加入5μL 1×107拷贝/μL的阳性对照(试剂盒提供)，充分震荡1分钟，得1×106拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
4．换枪头，在5号管中加入5μL 1×106拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×105拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
5．换枪头，在4号管中加入5μL 1×105拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×104拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
6．重复上面的操作直到得到6个稀释度的标准曲线样品。放冰上用。
二、样品DNA的制备7．如果有N个样品，必须设置N+2个提取，多出的一个是样品制备PC(样品制备阳性对照)，一个是样品制备NC(样品制备阴性对照)。可以用10μL阳性对照的10000倍稀释液再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样，以此作为样品制备PC。另外用水作为样品制备NC。
8．用自选方法纯化样品的DNA，本试剂盒跟市场上大多数DNA提取试剂盒兼容。
三、Probe qPCR反应(20μL体系，在样品制备室进行)
9．如果做定量分析并且只做1次重复，则标记N+9个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照(用水做模板)，6个用于标准曲线。如果做定性分析，并且只做1次重复，则标记N+4个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照(用水做模板)，1个用于PCR阳性对照(用第4号管中的阳性对照稀释液做模板)。下面只以定量分析为描述操作步骤，10．在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加)：
| 成分 | 样品管
N+2个 | PCR阴性
对照管 | 曲线样品管
(1～6管) |
| 2×Probe qPCR MagicMix | 10μL | 10μL | 各10μL |
| 猪托克特诺病毒1型探针法qPCR引物混合液-探针混合液 | 3μL | 3μL | 各3μL |
| N+2个待测DNA模板 | 7μL | 不加 | 不加 |
| 超纯水 | 不加 | 7μL | 不加 |
| 第6步所得标准曲线样品稀释液(1～6号) | 不加 | 不加 | 各7μL |
11．盖上盖子后上机，按下面参数进行PCR：
| 过程 | 温度 | 时间 |
| 预变性 | 95℃ | 5min |
qPCR反应
(40个循环) | 95℃ | 15sec |
| 60℃ | 1min(采集FAM通道的荧光信号) |
12．如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的log值为横轴，以Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的Ct值从标准曲线上推算出样品DNA浓度的log值，再推算出其浓度。
13．如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照Ct必须大于或等于40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct值应该小于或等于35。对待测样品，如果其Ct大于或等于40则为阴性，如果小于或等于35则为阳性。如果在35～40之间，则重复一次。重复实验的Ct值如果大于或等于40则为阴性，如果小于40，则为阳性。
