本公司开发麻风分枝杆菌染料法荧光定量PCR试剂盒。
背景资料： 麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)，俗称麻风杆菌，引起麻风，是一种慢性传染病。流行广泛。麻风分枝杆菌的形态、染色与结核分枝杆菌相似。麻风杆菌在病人体内分布(以瘤型一端病人为例)比较广泛。
产品特点：1．即开即用，用户只需要提供DNA模板。
2．引物根据麻风分枝杆菌专一区设计，特异性高。
3．荧光定量PCR检测，比常规PCR更加灵敏。
4．一管式闭管操作，降低了交叉污染。
5．本试剂盒足够50次20μL反应体系的荧光定量PCR。
6．本产品只适用于科研，不能用于临床诊断。
产品组成：| 组分 | 规格 |
| 2×qPCR MagicMix | 500μL |
| 荧光PCR专用模板稀释液 | 1mL |
| 麻风分枝杆菌染料法qPCR引物混合液 | 100μL |
| 麻风分枝杆菌染料法qPCR阳性对照(1×108拷贝/μL) | 50μL |
保存：-20℃，有效期一年。
使用方法： 一、稀释PCR阳性对照(以10
2～10
7拷贝/μL这6个10倍稀释度为例)注意：由于阳性对照浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分)。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供可以直接使用的DNA片段作为阳性对照。
1．标记6个离心管，分别为7，6，5，4，3，2。
2．用带芯枪头分别加入45μL荧光PCR专用模板稀释液(最好用带芯枪头，下同)。
3．在7号管中加入5μL 1×108拷贝/μL的阳性对照，充分震荡1分钟，得1×107拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。
4．换枪头，在6号管中加入5μL 1×107拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×106拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。
5．换枪头，在5号管中加入5μL 1×106拷贝/μL的阳性对照到5号管中，充分震荡1分钟，得1×105拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。
6．重复上面的操作直到得到6个稀释度的阳性对照。放冰上待用。
二、样品DNA的制备7．如果有N个样品，必须设置N+2个提取，多出的一个是PC(样品制备阳性对照)，一个是NC(样品制备阴性对照)。可以用10μL qPCR阳性对照的10000倍稀释的(稀释后浓度为1×104拷贝/μL，10μL相当于1万拷贝，可以将10μL原液加入到990μL自备TE溶液中，充分混匀，此为100倍稀释液。再取10μL此稀释液加入到990μL自备TE溶液中，充分混匀，此为10000倍稀释液)再加上一定量的水作为制备的阳性对照(加水后其总体积跟样品一样，样品体积多少取决于所用试剂盒的要求)。可以用水作为制备的阴性对照。制备所得成为样品DNA。
8．用自选方法纯化N+2个样品的DNA，本试剂盒跟市场上大多数核酸提取试剂盒兼容。
三、设置qPCR反应(20μL体系，在样品制备室进行)
9．如果做定量分析并且只做1次重复，则标记N+9个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照，6个用于标准曲线。如果做定性分析，并且只做1次重复，则标记N+4个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照(用水做模板)，1个用于PCR阳性对照(用第4号阳性对照稀释液，浓度为10E4拷贝/μL)。下面只描述定量分析的步骤，定性分析只是把6个标曲反应缩减成1个，其余不变。
10．在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加)：
| 成分 | 样品管
N+2个 | PCR阴性
对照管 | PCR阳性对照管
(2～7管) |
| 2×qPCR MagicMix | 10μL | 10μL | 各10μL |
| 麻风分枝杆菌染料法qPCR引物混合液 | 2μL | 2μL | 各2μL |
| 自备10×ROX(见注) | 2μL | 2μL | 各2μL |
| N+2待测样品cDNA模板 | 6μL | - | - |
| 自备超纯水 | - | 6 | - |
| 第7步所得PCR阳性对照稀释液(2～7号) | - | - | 各6μL |
注：仅ABI7500、7700和7900仪器需要使用ROX作为对照，其他荧光PCR仪器(如iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、RotorGene3000、RotorGene 6000和LightCycler480)不需要使用ROX，则用水替代。
11．盖上盖子后上机，按下面参数进行PCR(具体PCR参数可以根据仪器不同而自行优化)。
| 过程 | 温度 | 时间 |
| 预变性 | 95℃ | 5min |
PCR反应
(40个循环) | 95℃ | 15sec |
| 60℃ | 1min，(采集SYBR通道的荧光信号) |
| 按仪器预设程序进行熔解曲线分析 |
12．如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的log值为横轴，以Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的Ct值从标准曲线上推算出样品cDNA浓度的log值，再推算出其浓度。
13．如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照Ct必须大于或等于36。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct值应该小于或等于30。对待测样品，如果其Ct大于或等于35则为阴性，如果小于或等于30则为阳性。如果在30～35之间，则重复一次。若重复结果Ct值小于35，扩增曲线有明显起峰，该样本判断为阳性，否则为阴性。
