本公司开发了简单快捷的松鼠猴疱疹病毒探针法荧光定量PCR检测试剂盒。
背景资料： 松鼠猴疱疹病毒(Herpesvirus Saimiri，HVS)会引起恶性卡他热病，自然感染的情况下，老龄松鼠猴和幼龄松鼠猴相对比较少发病。病松鼠猴往往突然出现高热，体温升高呈稽留热，且体质迅速虚弱，接着眼、口、鼻黏膜很快出现严重炎症。双眼不停流泪，眼脸发生肿胀闭合，且有纤维素性脓性分泌物流出，角膜发生混浊，甚至形成溃疡，最终导致失明。这一疾病对松鼠猴的生命健康造成巨大危害，因此松鼠猴疱疹病毒的快速准确鉴定对该病的预防和检疫有着重要作用。
产品特点：1．即开即用，用户只需要提供样品DNA模板。
2．根据松鼠猴疱疹病毒保守区域设计引物和探针，能专一性地检测出样品中的松鼠猴疱疹病毒。
3．提供阳性对照，便于区分假阴性样品。
4．一管式闭管操作，降低了交叉污染。
5．只能用于科研，足够50次20μL体系的荧光定量PCR。
产品组成：| 组分 | 规格 |
| 2×Probe qPCR Magic Mix | 500μL |
| 荧光PCR专用模板稀释液 | 1mL |
| 松鼠猴疱疹病毒探针法qPCR引物混合液 | 100μL |
| 松鼠猴疱疹病毒qPCR探针 | 50μL |
| 松鼠猴疱疹病毒探针法qPCR阳性对照(1×108拷贝/μL) | 50μL |
保存：-20℃，有效期一年。
使用方法： 一、稀释标准曲线样品(以10
2～10
7拷贝/μL这6个10倍稀释度为例)。
由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分)
1．标记6个离心管，分别为7，6，5，4，3，2。
2．用带芯枪头分别加入45μL荧光PCR专用模板稀释液，最好用带芯枪头，下同)。
3．在7号管中加入5μL 1×108拷贝/μL的阳性对照(试剂盒提供)，充分震荡1分钟，得1×107拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
4．换枪头，在6号管中加入5μL 1×107拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×106拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
5．换枪头，在5号管中加入5μL 1×106拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×105拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
6．重复上面的操作直到得到6个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。
二、样品DNA的制备7．如果有N个样品，最好设置N+2个提取，多出的一个是PC(样品制备阳性对照)，一个是NC(样品制备阴性对照)。可以用10μL阳性对照的10000倍稀释液再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样，以此作为PC。另外用水作为NC。
8．用自选方法纯化样品的DNA，本试剂盒跟市场上大多数DNA提取试剂盒兼容。
三、Probe qPCR反应(20μL体系，在样品制备室进行)
9．如果做定量分析并且只做1次重复，则标记N+9个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照(用水做模板)，6个用于标准曲线。如果做定性分析，并且只做1次重复，则标记N+4个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照(用水做模板)，1个用于PCR阳性对照(用第4号管的阳性对照稀释液做模板)。下面只以定量分析为例描述操作步骤。
10．在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加)：
| 成分 | 样品管
N+2个 | PCR阴性
对照管 | 曲线样品管
(2～7管) |
| 2×Probe qPCR MagicMix | 10μL | 10μL | 各10μL |
| 松鼠猴疱疹病毒qPCR探针 | 1μL | 1μL | 各1μL |
| 松鼠猴疱疹病毒探针法qPCR引物混合液 | 2μL | 2μL | 各2μL |
| N+2个待测DNA模板 | 7μL | - | - |
| 超纯水 | - | 7μL | - |
| 第7步所得标准曲线样品稀释液(2～7号) | - | - | 各7μL |
11．盖上盖子后上机，按下面参数进行PCR：
| 过程 | 温度 | 时间 |
| 预变性 | 95℃ | 5min |
PCR反应
(40个循环) |
| 95℃ | 15sec |
| 60℃ | 1min(采集FAM通道的荧光信号) |
12．如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的log值为横轴，以Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的Ct值从标准曲线上推算出样品RNA浓度的log值，再推算出其浓度。
13．如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照Ct必须大于或等于40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct值应该小于或等于30。对待测样品，如果其Ct大于或等于40则为阴性，如果小于或等于30则为阳性。如果在30～40之间，则重复一次。若重复结果Ct值小于40，扩增曲线有明显起峰，该样本判断为阳性，否则为阴性。
