本试剂盒采用夹心法酶联免疫吸附法，用于体外定量分析人血清、血浆、细胞培养上清、细胞裂解液中Endothelin的含量。
检测原理： 预先包被的抗体为Endothelin单克隆抗体。检测相抗体也为Endothelin单克隆抗体，经生物素标记。样品和生物素标记抗体先后加入酶标板孔反应后，PBS或TBS洗涤。随后加入过氧化物酶标记的亲和素反应；经过PBS或TBS的彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的Endothelin呈正相关。血清、血浆、细胞培养上清标本用本试剂盒所检测的Endothelin主要是有活性的成熟蛋白质。
背景资料： 内皮素是一种(类)由内皮细胞合成的生物活性肽，由21个氨基酸构成。哺乳类动物能合成四种内皮素，包括ET-1、ET-2、ET-3和小鼠内皮素。它们均具有强烈的收缩血管、加强心肌收缩力、加强平滑肌收缩和促进神经内分泌功能等作用。其中又以ET-1活性最强。内皮素分布于血管平滑肌、肾、心、肺、脑、脊髓灰质、神经、肝、脾、肠、气管以及生殖系统之中，同这些器官上的特异受体有高度亲和力。很多物理、化学和生物因素均能刺激ET的大量释放，参加机体的多种病理生理过程。
基本信息： 检测指标：Endothelin-1；ET-1；Preproendothelin-1；PPET1；EDN1
检测范围：3.9pg/mL～250pg/mL
特异性：系统和其它细胞因子无交叉反应
敏感性：＜0.15pg/mL
产品组成：| 组分 | 规格 | 数量 |
| 预包被抗人Endothelin抗体的96孔板 | 96T | 1板 |
| 重组人Endothelin标准品(冻干) | 1ng/管 | 2管 |
| 生物素标记抗人Endothelin(100X) | 100μL | 1管 |
| 亲和素-过氧化物酶复合物(ABC)(100X) | 100μL | 1管 |
| 样品稀释液 | 30mL | 1瓶 |
| 抗体稀释液 | 12mL | 1瓶 |
| ABC稀释液 | 12mL | 1瓶 |
| TMB显色液 | 10mL | 1瓶 |
| 终止液 | 10mL | 1瓶 |
| 洗涤缓冲液(25X) | 20mL | 1瓶 |
| 封板膜 | | 4张 |
保存：2～8℃，有效期6个月。长期不用请置于-20℃可保存1年。
自备器材：1．标准规格酶标仪。
2．自动洗板机。
3．恒温箱
4．系列可调节移液器及吸头，一次检测样品较多时，最好用多通道移液器。
5．干净的试管和Eppendof管。
6．用去离子水将25X洗涤缓冲液稀释25倍，成1X洗涤缓冲液。
注意事项：1．使用前TMB显色液应为无色透明溶液，若发现颜色异常，请及时与我司联系。
2．用户在初次使用试剂盒时，应将各种试剂管离心数分钟，以便试剂集中到管底。
3．要严格避免操作过程中酶标板干燥。干燥会使酶标板上生物成份迅速失活。
4．为免交叉污染，要避免重复使用手中的吸头和试管。
5．禁止混用不同批次试剂盒内的试剂。
6．本公司提供的96孔酶标板是单条可拆型酶标板，用户可按需求使用；剩余的酶标板请按保存条件贮存。
7．揭封板膜和覆盖封板膜时应避免用力过大导致液体溅出。
洗板方法：● 手工洗板方法：吸去(不可触及板壁)或甩掉酶标板内的液体；在实验台上铺垫几层吸水纸，酶标板朝下用力拍几次；将1X洗涤缓冲液至少300μL注入孔内，浸泡1～2分钟。根据需要，重复此过程数次。
● 自动洗板：如果有自动洗板机，应在熟练使用后再用到正式实验过程中。
样品准备： 样品如果不立即分析，应分装后冷冻保存，且避免反复冻融。
● 细胞培养上清：离心去除沉淀，立即分析或分装后-20℃冷冻保存。
注意：细胞培养所用的牛血清可能含有高含量的Endothelin，应尽量避免使用。不能避免时，应做好适当的对照。
● 血清：用干净试管收集血液，室温凝固2小时或2～8℃过夜，离心1000×g 15分钟，收集血清。立即分析或分装后-20℃冷冻保存。
● 血浆—采用肝素或EDTA抗凝，抽血后30分钟内离心1000×g 15分钟。立即分析或分装后-20℃冷冻保存。
● 贴壁细胞：去除培养液，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍。加入适量裂解液，用枪吹打数下，使裂解液和细胞充分接触。通常10秒后，细胞就会被裂解。
● 悬浮细胞：离心收集细胞，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍。加入适量裂解液，用枪吹打把细胞吹散，用手指轻弹以充分裂解细胞。充分裂解后，10000～14000g离心3～5分钟，取上清。立即分析或分装后-20℃冷冻保存。
样品稀释： 用户须估计样品待测因子的含量，决定适当的稀释倍数，以使稀释后样品中待测因子的浓度处于ELISA试剂盒的最佳检测范围。根据待测因子含量高、中、低的不同，分别采取不同的稀释方案，以下方案仅供参考，样品的稀释应有详细记录。
● 高：指待测因子在2.5～25ng/mL。按1:100稀释。297μL样品稀释液加3μL样品。
● 中：指待测因子在250～2500pg/mL。按1:10稀释。225μL样品稀释液加25μL样品。
● 低：指待测因子在3.9～250pg/mL。按1:2稀释。120μL样品稀释液加120μL样品。
● 特低：指待测因子≤3.9pg/mL。样品一般不做稀释，或按1:2稀释。
试剂准备：A．Endothelin标准品的稀释和使用：在使用前2小时内准备。
试剂盒提供2管标准品，每管1ng，每次使用1管。
1．配制1000pg/mL标准品：取1mL样品稀释液加入标准品管内，盖好后静置10分钟以上，然后颠倒/搓动以助溶解。
2．配制250pg/mL标准品：取0.25mL 1000pg/mL的标准品加入有0.75mL样品稀释液的Eppendorf管中，混匀，做上标记。
3．配制125pg/mL～3.9pg/mL标准品：准备6只Eppendorf管，每管加0.3mL样品稀释液，分别标记上125pg/ml，62.5pg/mL，31.3pg/mL，15.6pg/mL，7.8pg/mL，3.9pg/mL。取0.3mL 250pg/mL的标准品加入标记125pg/mL的管中，混匀后同样取出0.3mL，加入下一只管中。余同此类推，直到最后一只样品管。如果用户希望的检测范围：1.95pg/mL～125pg/mL，也可参考上述方案配制标准品。
注意：已经稀释的标准品(1000pg/mL)，应在12小时内使用。-20℃冷冻保存条件下，2天内可以使用，不能反复冻融。
B．生物素标记抗人Endothelin抗体工作液的准备：在使用前2小时内准备。
1．根据每孔需要100μL计算总的用量(实际配制时应多配制100～200μL)。
2．按1μL生物素标记抗人Endothelin加抗体稀释液99μL的比例配制工作液。轻轻混匀。
C．亲和素-过氧化物酶复合物(ABC)工作液的准备：在使用前1小时内准备。
1．根据每孔需要100μL计算总的用量(实配时应多配制100～200μL)。
2．按1μL亲和素-过氧化物酶复合物(ABC)加ABC稀释液99μL的比例配制工作液。轻轻混匀。
已稀释好的ABC和TMB显色液在加入酶标板孔前都应预先在37℃中平衡至少30分钟。试剂或样品稀释时，切不可忘记混匀。每次检测都应该做标准曲线。用户须估计样品待测因子的含量，决定适当的稀释倍数。
1．确定本次检测所需的已包被抗体的酶标板孔数目，并增加1孔作为TMB空白显色孔。总数=样品数+9；做双份检测时×2。其余重包装好放入冰箱中。
2．将250pg/ml，125pg/ml，62.5pg/mL，31.3pg/mL，15.6pg/mL，7.8pg/mL，3.9pg/mL的标准品各100μL依次加入一排7孔中，1孔只加样品稀释液的作为零孔。对于人血清、血浆、细胞裂解液或细胞培养上清，直接加已用样品稀释液稀释的样品100μL。
3．酶标板加上封板膜，37℃反应90分钟。
4．反应后用自动洗板机吸去酶标板内的液体；或甩去酶标板内液体，再对着吸水纸拍几下。不洗。
5．将准备好的生物素抗人Endothelin抗体工作液按每孔100μL依次加入。(TMB空白显色孔除外)。
6．酶标板加上封板膜，37℃反应60分钟。
7．1X洗涤缓冲液洗涤3次，每次浸泡1分钟左右(每孔洗液至少300μL)。
8．将准备好的ABC工作液按每孔100μL依次加入(TMB空白显色孔除外)。
9．酶标板加上封板膜，37℃反应30分钟。
10．1X洗涤缓冲液洗涤5次，每次浸泡1～2分钟左右(每孔洗液至少300μL)。
11．按每孔90μL依次加入已在37℃平衡30分钟的TMB显色液，37℃避光反应20～25分钟。
注意：显色时间供参考，因用户实验室条件差异，最佳显色时间会有所不同。此时肉眼可见标准品的前3～4孔有明显的梯度蓝色，后3～4孔差别不明显。
12．按每孔100μL依次加入终止液，此时蓝色立转黄色。
13．用酶标仪在450nm测定O.D.值。
有两种设定空白对照的方案：
① 将TMB空白显色孔(只加TMB显色液和终止液)设为对照。所有的标准品和样品的吸光值减去TMB空白显色孔的吸光值后，在坐标纸上画出曲线，以吸光值作为纵坐标，以浓度作为横坐标。
② 将零孔设为对照。所有的标准品和样品的吸光值减去零孔的吸光值后，得到的数据可以直接在坐标纸上画出曲线。
14．根据样品的吸光值在坐标上找出对应的浓度。用户也可以使用各种应用软件来计算。应记住由于样品稀释了N倍，其实际浓度应该×N。
操作总结：1．加样品和标准品，37℃反应90分钟。不洗。
2．加生物素标记抗体，37℃反应60分钟。1X洗涤缓冲液洗涤3次。
3．加ABC，37℃反应30分钟。1X洗涤缓冲液洗涤5次。
4．TMB 37℃反应20～25分钟。
5．加入终止液，读数。
参考数据： 取自某些批次质检数据，仅供参考，用户需要自己建立标准曲线。
| 浓度(pg/ml) | 0 | 3.9 | 7.8 | 15.6 | 31.2 | 62.5 | 125 | 250 |
| OD值 | 0.019 | 0.047 | 0.085 | 0.178 | 0.410 | 0.879 | 1.813 | 2.570 |
| 浓度(pg/ml) | 0 | 3.9 | 7.8 | 15.6 | 31.2 | 62.5 | 125 | 250 |
| OD值 | 0.009 | 0.055 | 0.095 | 0.171 | 0.356 | 0.715 | 1.427 | 2.416 |
