本试剂盒采用夹心法酶联免疫吸附法，用于体外定量分析大鼠血清、血浆、细胞裂解液或细胞培养上清中ICAM-1的含量。
检测原理： 预先包被的抗体为ICAM-1单克隆抗体。检测相抗体为近100%纯度的ICAM-1亲和纯化多克隆抗体，经生物素标记。样品和生物素标记抗体先后加入酶标板孔反应后，PBS或TBS洗涤。随后加入过氧化物酶标记的亲和素反应；经过PBS或TBS的彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的大鼠ICAM-1呈正相关。
背景资料： ICAM-1是一种糖蛋白质，分子量85～110KDa。结合LFA-1和Mac-1，参与细胞的粘附。ICAM-1在白细胞，上皮细胞和非生长状态内皮细胞仅有微弱表达，但受IFN，TNF-a,IL-1β和LPS的刺激而增加。
可溶性ICAM-1以生物活性形式出现在血清中，可能是从细胞表面酶切下来的产物。各种炎症如感染性休克，LAD，癌症和移植，血中浓度都会升高。本试剂盒所用的标准品是基因重组表达产物，是一个二硫键连接的二聚体蛋白质，单链共493个氨基酸，分子量约78KDa，由于糖化结果，SDS-PAGE显示分子量为110～125KDa，是ICAM-1位于细胞膜外的部分。
基本参数： 检测指标：ICAM-1；ICAM1；CD54
检测范围：31.2pg/ml～2000pg/ml
特异性：系统和其它细胞因子无交叉反应
敏感性：＜1pg/ml
产品组成：| 组分 | 规格 | 数量 |
| 预包被抗大鼠ICAM-1抗体的96孔板 | 96T | 1板 |
| 重组大鼠ICAM-1标准品(冻干) | 10ng/管 | 2管 |
| 生物素标记抗大鼠ICAM-1(100X) | 100μL | 1管 |
| 亲和素-过氧化物酶复合物(ABC)(100X) | 100μL | 1管 |
| 样品稀释液 | 30mL | 1瓶 |
| 抗体稀释液 | 12mL | 1瓶 |
| ABC稀释液 | 12mL | 1瓶 |
| TMB显色液 | 10mL | 1瓶 |
| 终止液 | 10mL | 1瓶 |
| 洗涤缓冲液(25X) | 20mL | 1瓶 |
| 封板膜 | | 4张 |
保存：2～8℃，有效期6个月。长期不用请置于-20℃可保存1年。
自备器材：1．标准规格酶标仪。
2．自动洗板机。
3．恒温箱
4．系列可调节移液器及吸头，一次检测样品较多时，最好用多通道移液器。
5．干净的试管和Eppendof管。
6．用去离子水将25X洗涤缓冲液稀释25倍，成1X洗涤缓冲液。
注意事项：1．使用前TMB显色液应为无色透明溶液，若发现颜色异常，请及时与我司联系。
2．用户在初次使用试剂盒时，应将各种试剂管离心数分钟，以便试剂集中到管底。
3．要严格避免操作过程中酶标板干燥。干燥会使酶标板上生物成份迅速失活。
4．为免交叉污染，要避免重复使用手中的吸头和试管。
5．禁止混用不同批次试剂盒内的试剂。
6．本公司提供的96孔酶标板是单条可拆型酶标板，用户可按需求使用；剩余的酶标板请按保存条件贮存。
7．揭封板膜和覆盖封板膜时应避免用力过大导致液体溅出。
洗板方法：● 手工洗板方法：吸去（不可触及板壁）或甩掉酶标板内的液体；在实验台上铺垫几层吸水纸，酶标板朝下用力拍几次；将1X洗涤缓冲液至少300μL注入孔内，浸泡1～2分钟。根据需要，重复此过程数次。
● 自动洗板：如果有自动洗板机，应在熟练使用后再用到正式实验过程中。
样品准备： 样品如果不立即分析，应分装后冷冻保存，且避免反复冻融。
● 细胞培养上清：离心去除沉淀，立即分析或分装后-20℃冷冻保存。
● 血清：用干净试管收集血液，室温凝固30分钟，离心1500×g 15分钟，收集血清。立即分析或分装后-20℃冷冻保存。
● 血浆：用干净试管收集，EDTA或肝素抗凝血液，30分钟内离心，1500×g 15分钟，收集血浆。立即分析或分装后-20℃冷冻保存。
● 贴壁细胞：去除培养液，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍。加入适量裂解液，用枪吹打数下，使裂解液和细胞充分接触。通常10秒后，细胞就会被裂解。
● 悬浮细胞：离心收集细胞，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍。加入适量裂解液，用枪吹打把细胞吹散，用手指轻弹以充分裂解细胞。充分裂解后，10000～14000g离心3～5分钟，取上清。立即分析或分装后-20℃冷冻保存。
样品稀释： 用户须估计样品待测因子的含量，决定适当的稀释倍数，以使稀释后样品中待测因子的浓度处于ELISA试剂盒的最佳检测范围。根据待测因子含量高、中、低的不同，分别采取不同的稀释方案，以下方案仅供参考，样品的稀释应有详细记录。
● 高：指待测因子在20～200ng/ml。一般按1:100稀释。297μL样品稀释液加3μL样品。
● 中：指待测因子在2～20ng/ml。一般按1:10稀释。225μL样品稀释液加25μL样品。
● 低：指待测因子在31.2～2000pg/ml。按1:2稀释。100μL样品稀释液加100μL样品。
● 特低：指待测因子≤31.2pg/ml。样品一般不做稀释，或按1:2稀释。
试剂准备：A．大鼠ICAM-1标准品的稀释和使用：在使用前2小时内准备。试剂盒提供2管标准品，每管10ng，每次使用1管。
1．配制10,000pg/ml标准品：取1mL样品稀释液加入标准品管内，盖好后静置10分钟以上，然后反复颠倒/搓动以助溶解。
2．配制2000pg/ml标准品：取0.2mL 10,000pg/ml的标准品加入有0.8mL样品稀释液的Eppendorf管中，混匀，做上标记。
3．配制1000pg/ml～31.2pg/ml标准品：准备6只Eppendorf管，每管加0.3mL样品稀释液，分别标记上1000pg/ml,500pg/ml，250pg/ml，125pg/ml，62.5pg/ml，31.2pg/ml。取0.3mL 2000pg/ml的标准品加入标记1000pg/ml的管中，混匀后同样取出0.3mL，加入下一只管中。余同此类推，直到最后一只样品管。
注意：已经稀释的标准品（10,000pg/ml），应在12小时内使用。-20℃冷冻保存条件下，2天内可以使用，但不得反复冻融。
B．生物素标记抗大鼠ICAM-1抗体工作液：在使用前2小时内准备。
1．根据每孔需要100μL计算总的用量（实际配制时应多配制100～200μL）。
2．按1μL生物素标记抗大鼠ICAM-1加抗体稀释液99μL的比例配制工作液。轻轻混匀。
C．亲和素-过氧化物酶复合物（ABC）工作液的准备：在使用前1小时内准备。
1．根据每孔需要100μL计算总的用量（实配时应多配制100～200μL）。
2．按1μL亲和素-过氧化物酶复合物（ABC）加ABC稀释液99μL的比例配制工作液。轻轻混匀。
已稀释好的ABC和TMB显色液在加入酶标板孔前都应预先在37℃中平衡至少30分钟。试剂或样品稀释时，切不可忘记混匀。每次检测都应该做标准曲线。用户须估计样品待测因子的含量，决定适当的稀释倍数。
1．确定本次检测所需的已包被抗体的酶标板孔数目，并增加1孔作为TMB空白显色孔。总数=样品数+9；做双份检测时×2。其余重包装好放入冰箱中。
2．将2000pg/ml,1000pg/ml，500pg/ml，250pg/ml，125pg/ml，62.5pg/ml，31.2pg/ml的标准品各100μL依次加入一排7孔中，1孔只加样品稀释液的作为零孔。对于血清、血浆、细胞裂解液或细胞培养上清，每孔加100μL已用样品稀释液稀释的样品。
3．酶标板加上封板膜，37℃反应90分钟。
4．反应后用自动洗板机吸去酶标板内的液体；或甩去酶标板内液体，再对着吸水纸拍几下。不洗。
5．将准备好的生物素抗大鼠ICAM-1抗体工作液按每孔100μL依次加入（TMB空白显色孔除外）。
6．酶标板加上封板膜，37℃反应60分钟。
7．1X洗涤缓冲液洗涤3次，每次浸泡1分钟左右（每孔洗液至少300μL）。
8．将准备好的ABC工作液按每孔100μL依次加入（TMB空白显色孔除外）。
9．酶标板加上封板膜，37℃反应30分钟。
10．1X洗涤缓冲液洗涤5次，每次浸泡1～2分钟左右（每孔洗液至少300μL）。
11．按每孔90μL依次加入已在37℃平衡30分钟的TMB显色液，37℃避光反应15～20分钟。
注意：显色时间供参考，因用户实验室条件差异，最佳显色时间会有所不同。此时肉眼可见标准品的前3～4孔有明显的梯度蓝色，后3～4孔差别不明显。
12．按每孔100μL依次加入终止液，顺序同加TMB。此时蓝色立转黄色。
13．用酶标仪在450nm测定O.D.值。
有两种设定空白对照的方案：
① 将TMB空白显色孔(只加TMB显色液和终止液)设为对照。所有的标准品和样品的吸光值减去TMB空白显色孔的吸光值后，在坐标纸上画出曲线，以吸光值作为纵坐标，以浓度作为横坐标。
② 将零孔设为对照。所有的标准品和样品的吸光值减去零孔的吸光值后，得到的数据可以直接在坐标纸上画出曲线。
14．根据样品的吸光值在坐标上找出对应的浓度。用户也可以使用各种应用软件来计算。应记住由于样品稀释了N倍，其实际浓度应该×N。
操作总结：1．加样品和标准品，37℃反应90分钟。不洗。
2．加生物素标记抗体，37℃反应60分钟。1X洗涤缓冲液洗涤3次。
3．加ABC，37℃反应30分钟。1X洗涤缓冲液洗涤5次。
4．TMB 37℃反应15～20分钟。
5．加入终止液，读数。
参考数据： 取自某些批次质检数据，仅供参考，用户需要自己建立标准曲线。
| 浓度(pg/ml) | 0 | 31.2 | 62.5 | 125 | 250 | 500 | 1000 | 2000 |
| OD值 | 0.030 | 0.083 | 0.129 | 0.235 | 0.437 | 0.845 | 1.378 | 2.021 |
