| 8. 使用前请检查 Buffer 1# 是否出现结晶或者沉淀，可置于 56℃水浴重新溶解。Buffer 1# 在使用前请加入β-巯基乙醇，至终浓度为 1%。如 1 ml Buffer 1# 加 10 μl β-巯基乙醇。加入β-巯基乙醇的 Buffer 1# 室温可保存 1 个月。 |
| 9.所有离心步骤若无特殊说明均在室温下进行，且所有操作步骤动作要迅速。 |
| 操作步骤 | |
| 1. 4℃ 10,000 rpm（~13,400×g）离心2min收集菌体（菌体量最大不超过1×109），小心去除所有上清。 |
| 注意：上清如果有残留，会影响后续的消化过程。 |
| 2. 用含有Lysozyme的100 μl TE缓冲液彻底重悬菌体，室温孵育。具体配方和孵育时间如下： |
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| | TE 缓冲液中 Lysozyme 的终浓度 孵育时间 | |
| | G-细菌 400 μg/ml 3-5 min | |
| | G+细菌 3 mg/ml 5-10 min | |
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| 3. 加入350 μl Buffer 1#（使用前请检查是否加入β-巯基乙醇），涡旋震荡混匀（此步骤可能出现不溶性沉淀）。将溶液与沉淀全部加入到已装入收集管的过滤柱中，10,000 rpm离心2min，收集滤液，弃掉过滤柱。 |
| 4. 向上步得到的滤液中加入250 μl无水乙醇，混匀（此时可能会出现沉淀）。将得到的溶液和沉淀一起转入到吸附柱(吸附柱应预先装入收集管中)中，10,000 rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。 |
| 5. 向吸附柱中加入350 μl Buffer 2#，10,000 rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。 |
| 6. 配制DNase I 混合液：取52 μl RNase-Free Water，向其中加入8 μl 10 × Reaction Buffer 和20 μl DNase I（1 U/μl），混匀， 配制成终体积为80 μl的反应液。
注意: 以上体系为按照我公司产品DNase I （Cat No：DY6060）反应体系进行配置，应用其他公司产品请参考相应说明书。 |
| 7. 向吸附柱中直接加入80 µl DNase I 混合液，20-30℃孵育15min。 |
| 8. 向吸附柱中加入350 μl Buffer 2#, 10,000 rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。 |
| 9. 向吸附柱中加入500 μl Buffer 3#（使用前检查是否加入无水乙醇）, 10,000 rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。 |
| 10. 重复步骤6。 |
| 11. 12,000 rpm 离心 2 min，倒掉收集管中的废液。将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干。 |
| 注意：这一步的目的是将吸附柱中残余乙醇去除，乙醇残留会影响后续的酶促反应(酶切、PCR等)。 |
| 12. 将吸附柱置于一个新的无RNase的离心管中，向吸附柱的中间部位加入30-50 μl Buffer 4#室温放置1min，10,000 rpm离心1min，收集RNA溶液，-70℃保存RNA，防止降解。 |
