1．标准曲线绘制。
取一块酶标板，按以下表格数据加入试剂：
| 孔号 | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 |
| 蛋白标准工作液(μl) | 0 | 1 | 2 | 4 | 8 | 12 | 16 | 20 |
| 生理盐水/PBS(μl) | 20 | 19 | 18 | 16 | 12 | 8 | 4 | 0 |
| 对应的蛋白含量(μg) | 0 | 1 | 2 | 4 | 8 | 12 | 16 | 20 |
| 相当于标准品浓度(mg/mL) | 0 | 0.05 | 0.1 | 0.2 | 0.4 | 0.6 | 0.8 | 1 |
注：
● 此操作方法采用简便快速的步骤，对加样得到准确性要求较高，一定要注意实验操作规范，提高上样量的精确度。
● 也可以采用倍比稀释流程配制蛋白标准品。
● 每次测定蛋白前都需重做标准曲线。
● BSA标准品的稀释液最好与待测样品的稀释液一致。如果不方便使用的话，可用0.9%生理盐水或1×PBS或纯水稀释。
2．按上表数据在做好标记的96孔板微孔中稀释好蛋白标准品并充分混匀。
3．样品检测。分别在做好标记的其他待测孔加好20μL待测蛋白样品(原液或稀释液)。
注：
● 推荐每个待测定的样本做2～3个平行反应。
● 根据已知大概蛋白浓度范围或预实验数据，将待测蛋白样品稀释至适当浓度。
4．在标准曲线孔和待测样品孔分别每孔加入200μL BCA工作液。充分混匀。
5．盖上96孔板盖，37℃放置30分钟。
注：如果蛋白浓度较低时，可以室温放置2小时或者60℃放置30分钟，颜色会随着时间的延长不断加深，显色反应也会随着温度升高而加快。
6．在5分钟内完成酶标仪检测。
7．用酶标仪测定A562，以不含BSA的光吸收值(0号孔)为空白对照。
8．以蛋白含量(μg)为横坐标，吸光值为纵坐标，绘出标准曲线。
注：由于操作误差导致标准品读数严重偏离线性曲线的应舍去。
9．根据测得的吸收值，在标准曲线上即可查得待测样品的蛋白含量。
注：
● 待测未知样品浓度可以从标准曲线方程中计算得出，实际浓度需要乘以样品的稀释倍数。
● 如果得到的蛋白浓度不在检测范围内，重新稀释样品后再次测定。
10．计算蛋白浓度：
以查得的蛋白含量除以样品体积20μL，再乘以样品检测前相应的稀释倍数即可得到待测样品的实际浓度。
1．标准曲线绘制。
在比色皿/试管中，按以下表格数据加入试剂：
| 孔号 | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 |
| 蛋白标准工作液(μl) | 0 | 5 | 10 | 20 | 40 | 60 | 80 | 100 |
| 生理盐水/PBS(μl) | 100 | 95 | 90 | 80 | 60 | 40 | 20 | 0 |
| 对应的蛋白含量(μg) | 0 | 5 | 10 | 20 | 40 | 60 | 80 | 100 |
| 相当于标准品浓度(mg/mL) | 0 | 0.05 | 0.1 | 0.2 | 0.4 | 0.6 | 0.8 | 1 |
注：
● 此操作方法采用简便快速的步骤，对加样得到准确性要求较高，一定要注意实验操作规范，提高上样量的精确度。
● 也可以采用倍比稀释流程配制蛋白标准品。
● 每次测定蛋白前都需重做标准曲线。
● BSA标准品的稀释液最好与待测样品的稀释液一致。如果不方便使用的话，可用0.9%生理盐水或1×PBS或纯水稀释。
2．按上表数据在做好标记的比色皿中稀释好蛋白标准品并充分混匀。
3．样品检测。分别在做好标记的其他待测比色皿中加好100μL待测蛋白样品(原液或稀释液)。
注：
● 推荐每个待测定的样本做2～3个平行反应。
● 根据已知大概蛋白浓度范围或预实验数据，将待测蛋白样品稀释至适当浓度。
4．在标准曲线孔和待测样品孔分别每孔加入2mL BCA工作液。充分混匀。
5．37℃放置30分钟。
6．在5分钟内完成分光光度计检测。
7．以不含BSA的光吸收值(0号孔)为空白对照，用分光光度计测定A562。
8．以蛋白含量(μg)为横坐标，吸光值为纵坐标，绘出标准曲线。
注：由于操作误差导致标准品读数严重偏离线性曲线的应舍去。
9．根据测得的吸收值，在标准曲线上即可查得待测样品的蛋白含量。
注：
● 待测未知样品浓度可以从标准曲线方程中计算得出，实际浓度需要乘以样品的稀释倍数。
● 如果得到的蛋白浓度不在检测范围内，重新稀释样品后再次测定。
10．计算蛋白浓度：
以查得的蛋白含量除以样品体积100μL，再乘以样品检测前相应的稀释倍数即可得到待测样品的实际浓度。
