本试剂盒基于SABC系统,适用于一抗类型为山羊IgG的免疫荧光检测。SABC-Cy3将链霉亲和素-生物素引入荧光系统,能进一步提高敏感性及降低背景。Cy3比传统上的荧光更具有亲水性,因而不会因疏水性而引起非特异性吸附或聚合,从而背景更低。而且其敏感性和稳定性都更好。Cy3在554nm激化,在568~574nm发射荧光,呈鲜红色。
A.
石蜡片热修复染色步骤:1.石蜡切片,常规脱蜡至水。
2.根据需要选择抗原修复方式及强度。可热修复、酶修复或不修复。
3.热修复抗原:将切片浸入到EDTA修复液中,微波炉加热到沸腾后断电,间隔5~10min再修复1~2次,冷却。
4.滴加稀释的正常兔血清封闭液(稀释比1:10),室温20min,甩干,勿洗。
5.滴加适当稀释的一抗,37℃孵育1~2小时或4℃过夜。PBS冲洗,5min×3次。
6.滴加稀释的生物素标记兔抗山羊IgG,37℃孵育30min。PBS冲洗,5min×3次。
7.滴加稀释的SABC-Cy3,37℃孵育30min。PBS冲洗,5min×3次。
8.水溶性封片剂(
ZN2946)或抗荧光衰减封片剂(
ZN1974)封片。
9.荧光显微镜观察。
B.
石蜡片酶消化染色步骤: 将A程序的第4步:滴加酶消化液室温5~10min。酶修复可选用复合修复液(
ZN1952)、胰蛋白酶(
ZN2944)、胃蛋白酶(
ZN2945)消化组织。蒸馏水洗2min×3次。
C.
石蜡切片酶不消化/修复程序: 对于不需要微波修复或消化的抗原,省略A程序中的第4步即可。
D.
细胞片的染色步骤:1.爬片。圆形盖破片经防脱片剂处理(Poly-L-Lysine),灭菌,备用。贴壁细胞消化后加入放有盖玻片的24孔板中培养1~2天,使细胞贴壁。悬浮细胞则处理后直接涂片,使细胞贴附。
2.固定。4℃预冷4%多聚甲醛固定20min或冷丙酮固定10min。蒸馏水洗2min×3次。
3.打孔。0.25% Triton X-100处理细胞15min。(若采用丙酮固定则此步骤可省略)
4.酶消化处理室温5~10min。酶消化可选用复合修复液(
ZN1952)、胰蛋白酶(
ZN2944)、胃蛋白酶(
ZN2945)。蒸馏水洗2min×3次。
5.滴加稀释的正常兔血清封闭液(稀释比1:10),室温20min,甩干,勿洗。
6.滴加适当稀释的一抗,37℃孵育1~2小时或4℃过夜。PBS冲洗,5min×3次。
7.滴加稀释的生物素标记兔抗山羊IgG,37℃孵育30min。PBS冲洗,5min×3次。
8.滴加稀释的SABC-Cy3,37℃孵育30min。PBS冲洗,5min×3次。
9.水溶性封片剂(
ZN2946)或抗荧光衰减封片剂(
ZN1974)封片。
10.荧光显微镜观察。