在酸性环境中，过氧化氢可将Fe2+离子氧化成Fe3+离子，Fe3+离子再与染料分子结合形成Fe3+-染料复合物，该复合物在560nm或595nm处有最大吸收波长，且吸光值与过氧化氢的浓度成正比。本试剂盒针对溶解于脂相中的样品而设计，通过添加特殊的增敏剂，增强了过氧化氢的检测信号，使得过氧化氢的检测灵敏度得到很大提高，可应用于监测低密度脂蛋白和脂蛋白中脂类的氧化情况及细胞活性，血清或血浆中的过氧化氢含量和在有脂类物质存在的情况下，不要对生物样品抽提，直接定量分析过氧化氢含量。本试剂盒定量过氧化氢的浓度范围为1～250μM，可使用离心管法50次或酶标法250次。
A．
试剂准备1．按照以下公式计算所需的工作液总体积。
工作液总体积=(标准曲线测定点数+样品数)×重复次数×每个样品所需的工作液体积
2．根据所需的工作液总体积，取溶液A：溶液B=1：100，混匀制成工作液。
3．取一试管，加入1μL的30%过氧化氢溶液和8.8mL的纯净水，混匀配成1mM过氧化氢溶液。
4．取8支1.5mL离心管，按照下表平行操作，制备一系列的标准过氧化氢溶液。
| 成分/管号 | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 |
| 蒸馏水(μl) | 1000 | 999 | 990 | 950 | 900 | 850 | 800 | 750 |
| 1mM H2O2标准溶液(μl) | 0 | 1 | 10 | 50 | 100 | 150 | 200 | 250 |
| H2O2标准溶液浓度(μM) | 0 | 1 | 10 | 50 | 100 | 150 | 200 | 250 |
B．
离心管法(分光光度计法)1．制作标准曲线
a．取16支1.5mL离心管，编号为0~7，每组设置一个重复，分别加入100μL相应浓度的标准过氧化氢溶液。
b．各管加入1mL工作液，迅速混匀。
c．室温静置2～20min(建议设置静置时间梯度，使用新鲜的过氧化氢溶液，此步及过氧化氢溶液品质与标曲是否成线性关系有直接关联，建议设置梯度为2min，5min，10min)。
d．在分光光度计上测各管的A560值。
e．计算编号相同的两个离心管中A560的平均值。
f．以各管A560平均值为纵坐标，对应的过氧化氢浓度为横坐标，在坐标纸上或Microsoft Excel软件中绘制标准曲线。
2．未知样品过氧化氢浓度测定
a．将样品做适当的稀释。
b．取3支1.5mL离心管，其中一管加入100μL纯净水作为空白对照，其余两管分别加入100μL样品稀释液。
c．各管加入1mL工作液，迅速混匀。
d．室温静置20min。
e．在分光光度计上测各管的A560值。
f．计算两个相同浓度样品稀释液A560值的平均值。
g．根据两个相同浓度样品稀释液A560值的平均值，在标准曲线上确定出该样品稀释液的过氧化氢浓度。
h．根据下式计算样品的过氧化氢浓度
样品过氧化氢浓度(μM)=该样品稀释液的过氧化氢浓度×样品稀释倍数
C．
酶标板法1．制作标准曲线
a．在酶标板上取16个孔，编号为0~7，每组设置一个重复，分别加入20μL相应浓度的标准过氧化氢溶液。
b．各孔加入200μL工作液，将酶标板置于摇床上，振荡混匀30sec。
c．将酶标板于室温静置2～20min(建议设置静置时间梯度，使用新鲜的过氧化氢溶液，此步及过氧化氢溶液品质与标曲是否成线性关系有直接关联，建议设置梯度为2min，5min，10min)。
d．在酶标仪上测各孔的A595值。
e．计算相同编号的两孔A595值的平均值。
f．以各孔A595平均值为纵坐标，对应的过氧化氢浓度为横坐标，在坐标纸上或Microsoft Excel软件中绘制标准曲线。
2．未知样品过氧化氢浓度测定
a．将样品做适当的稀释。
b．在酶标板上取3个孔，其中一孔加入20μL纯净水作为空白对照，其余两孔分别加入20μL样品稀释液。
c．各孔加入200μL工作液，将酶标板置于摇床上，振荡混匀30sec。
d．将酶标板置于室温静置20min。
e．在酶标仪上测各孔的A595值。
f．计算两个相同浓度样品稀释液的A595值的平均值。
g．根据两个相同浓度样品稀释液A595值的平均值，在标准曲线上确定出该样品稀释液的过氧化氢浓度。
h．根据下式计算样品的过氧化氢浓度
i．样品过氧化氢浓度(μM)=该样品稀释液的过氧化氢浓度×样品稀释倍数。
D．
血清或血浆中的过氧化氢含量测量方法 由于血清或血浆中含有较低的过氧化氢，并且含有内源性的铁离子，产生的背景较高，所以采用过氧化氢的还原试剂TCEP(Tris[2-carboxyethyl]phosphine hydrochloride)测量背景吸收值，再根据标准曲线，从总的待测样品的吸收值减去内源性的铁离子背景吸收值，从而得出血清或血浆中过氧化氢的真实含量。
1．对于每个血清或血浆样品，取4支1.5mL离心管，各管分别加入90μL的血清或血浆样品。
2．其中两管加入10μL的甲醇，另外两管加入10μL含终浓度10mM TCEP的甲醇。
3．涡旋振荡几秒，在室温静置20～30min。
4．各管加入0.9mL工作液，迅速混匀。
5．涡旋振荡几秒，在室温静置20～30min。
6．12000g离心5～10min，转移一定量的上清(离心管法900μL或酶标板法300μL)，测量吸收值。
7．计算加入10μL的甲醇的两管和加入10μL含终浓度10mM TCEP的甲醇的两管的吸收值的平均值。
8．根据标准曲线和吸收值的平均值，计算出含有10μL的甲醇管的过氧化氢含量和含有10μL的含终浓度10mM TCEP的甲醇管的过氧化氢含量。
9．将含有10μL的甲醇管的过氧化氢含量减去含有10μL的终浓度10mM TCEP的甲醇管的过氧化氢含量，从而得出血清或血浆中过氧化氢的真实含量。
