1．首先根据所用RNA的量，按如下公式，用1mM Tris(pH8.0)来稀释10mM ATP：
ATP稀释系数=5000/__ng的总RNA
例：如果总RNA的起始用量为100ng，那么ATP稀释系数=5000/100=50。即将ATP稀释50倍(1μL的10mM ATP加49μL的1mM Tris,pH8.0)。
2．向冰浴中预冷的无RNase反应管中加入以下试剂至总体积25μL。
| 成分 | 用量 | 终浓度 |
| total RNA | X μL | 可达2μg |
| 10×Poly(A)Polymerase Buffer | 2.5μL | 1× |
| 第“1”步中稀释好的ATP | 1μL | — |
| E.coli Poly(A)Polymerase(5U/μL) | 0.5μL | 2.5U |
| RNase-Free Water | 至25μL | — |
注意：反应中使用的total RNA必须含有小分子RNA。此过程也可以直接使用小分子RNA(建议加入量为2～5μL。请根据目的miRNA的丰度来确定加入量)。
3．轻轻混匀上述反应液，短暂离心将液体收集于管底。37℃，孵育15分钟。此过程结束后，立刻进行第一链cDNA的合成，或于-20℃暂存。如需长期保存，建议存放于-80℃。
1．向冰浴中预冷的无RNase反应管中加入下表中试剂，至终体积20μL：
| 成分 | 用量 |
| 上述Poly(A)反应液 | 4μL |
| UltraPure dNTP Mix(10mM each) | 1μL |
| RT Primer(25μM) | 3μL |
| 5×UltraRT Buffer | 4μL |
| UltraRT | 0.5μL |
| RNase-Free Water | 7.5μL |
2．轻轻混匀上述反应液，短暂离心将液体收集于管底。42℃，孵育50分钟。
3．85℃，孵育5分钟，终止反应。合成的cDNA反应液可以直接进行荧光定量检测实验，也可以于-20℃保存备用。
