5、蛋白酶抑制剂抑制了蛋白的降解，蛋白酶抑制剂配方优化。蛋白酶抑制剂混合物包含7种独立的蛋白酶抑制剂；每一种抑制剂可特异性抑制某一种或几种蛋白酶活性。该混合物优化的组成使其可以抑制几乎所有重要的蛋白酶活性，包括丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、丙氨酰-氨基肽酶等。
1. 旋帽离心管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体甩至管底，避免开盖时液体洒落。
2. 实验过程中的所有试剂须预冷；所有器具须放-20℃冰箱预冷。整个过程须保持样品处于低温。
3. 蛋白酶抑制剂储存期间溶液如果出现沉淀，不影响使用，溶解后正常使用。
4. 可以根据自己实验需要加入其它蛋白酶抑制剂单品。
5. Western 实验内参可以选用Lamin A、Lamin B、TBP、Histon H3。
1. 提取液制备：每 200ul 冷的蛋白提取液A 和B 中分别加入2ul 蛋白酶抑制剂混合物和磷酸酶抑制剂，混匀后置冰上备用。
2. 取 5-10×106 个细胞①，在4℃，500×g 条件下离心2-3 分钟，小心吸取培养基，尽可能吸干，收集细胞。
3. 用冷 PBS 洗涤细胞两次，每次洗涤后尽可能吸干上清。
4. 每 20ul 细胞压积中加入200μl 冷的提取液 A，高速涡旋振荡15 秒或吹打混匀，置冰上15 分钟，中间每隔5 分钟涡旋振荡或吹打混匀。
5. 再次高速涡旋振荡 5 秒，然后在4℃，12000×g 条件下离心5 分钟。
6. 快速将上清吸入另一预冷的干净离心管，即可得到胞浆蛋白，请置于冰上或-80℃冰箱保存备用。
7. 沉淀用 PBS 洗涤一次，然后在4℃，12000×g 条件下离心5 分钟，弃上清。
8. 在沉淀中加入 200μl 冷的提取液B，高速涡旋振荡15 秒。
9. 置冰上 40 分钟，每隔10 分钟高速涡旋振荡15 秒。
10. 在 4℃，12000×g 条件下离心10 分钟。
11. 快速将上清吸入另一预冷的干净离心管，即可得到核蛋白。
12. 将上述蛋白提取物定量②后分装于-80℃冰箱保存备用或直接用于下游实验③。
注：
① 细胞数量根据实验情况调整，每次的提取液用量并不是一定的，请根据实际情况调整。
② 建议用BCA 法进行蛋白定量。
③ 蛋白样品－80℃存放一年没有问题。注意不要被蛋白酶水解掉，不要被细菌污染。
组织蛋白提取
1. 提取液制备：每 200ul 冷的蛋白提取液A 和B 中分别加入2ul 蛋白酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用。
2. 取适量组织样本剪碎，加冷PBS，用组织匀浆器匀浆①至无明显肉眼可见固体（或用液氮研磨），冰上静置5 分钟，小心将上清吸入另一预冷的干净离心管。
3. 在 4℃，500×g 条件下离心2-3 分钟，弃上清。
4. 每 20ul 细胞压积中加入200μl 冷的提取液 A，高速涡旋振荡15 秒或吹打混匀，置冰上15 分钟，中间每隔5 分钟涡旋振荡或吹打混匀。。
5. 再次高速涡旋振荡 5 秒，然后在4℃，12000×g 条件下离心5 分钟。
6. 快速将上清吸入另一预冷的干净离心管，即可得到胞浆蛋白，请置于冰上或-80℃冰箱保存备用。
7. 沉淀用 PBS 洗涤一次，然后在4℃，12000×g 条件下离心5 分钟，弃上清。
8. 在沉淀中加入 200μl 冷的提取液B，高速涡旋振荡15 秒。
9. 置冰上 40 分钟，每隔10 分钟高速涡旋振荡15 秒。
10. 在 4℃，12000×g 条件下离心10 分钟。
11. 快速将上清吸入另一预冷的干净离心管，即可得到核蛋白。
12. 将上述蛋白提取物定量②后分装于-80℃冰箱保存备用或直接用于下游实验③。
注：
① 用液氮研磨的方法更佳。
② 建议用BCA 法进行蛋白定量。
③ 蛋白样品－80℃存放一年没有问题。注意不要被蛋白酶水解掉，不要被细菌污染。
使用本产品的文献：
● Guang Yu, Tonghai Yan et al. Ser9 phosphorylation causes cytoplasmic detention of
I2PP2A/SET in Alzheimer disease
Neurobiology of Aging 2013 （IF=6.189）
● Xiaoling Ma et al. Staphylococcal Panton-Valentine Leukocidin Induces
Pro-Inflammatory Cytokine Production and Nuclear Factor-Kappa B Activation in Neutrophils
PloS one 2012 （IF=4.411）
● Jinchun Qian et al. Ophiopogonin D prevents H2O2-induced injury in primary human
umbilical vein endothelial cells
Journal of Ethnopharmacology 2010 Volume 128, Issue 2, Pages 438-445 （IF=2.466）
