5、蛋白酶抑制剂抑制了蛋白的降解，蛋白酶抑制剂配方优化。蛋白酶抑制剂混合物包含6种独立的蛋白酶抑制剂；每一种抑制剂可特异性抑制某一种或几种蛋白酶活性。该混合物优化的组成使其可以抑制几乎所有重要的蛋白酶活性，包括丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、丙氨酰-氨基肽酶等。
1. 旋帽离心管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体甩至管底，避免开盖时液体洒落。
2. 实验过程中的所有试剂须预冷；所有器具须放-20℃冰箱预冷。整个过程须保持样品处于低温。
3. 蛋白酶抑制剂储存期间溶液如果出现沉淀，不影响使用，溶解后正常使用。
4. 可以根据自己实验需要加入其它蛋白酶抑制剂单品。
5. Western 实验内参可以选用Tubulin、Na-K ATPase。
6. 更多蛋白提取常见问题分析等资料可以联系本公司索取。
A． 细胞蛋白提取
1. 取 5-10×106 个以上细胞①，在4℃，500g 条件下离心2-3 分钟，小心吸取培养基，尽可能吸干，收集细胞。
2. 用冷 PBS 洗涤细胞两次，每次洗涤后尽可能吸干上清。
3. 细胞样品中加入 200μl 冷的试剂 A，2ul 蛋白酶抑制剂混合物，高速涡旋振荡15 秒，置冰上10-15 分钟。
4. 再次高速涡旋振荡 5 秒，然后在4℃，13000×g 条件下离心5 分钟。
5. 快速将上清吸入另一预冷的干净离心管，37℃水浴5-10 分钟，37℃下②1000g-2000g 力离心5 分钟，此时溶液分为两层（对着光线看），下层是膜蛋白约为20-50μl。
6. 收集上层部分留作备用分析③。
7. 用 150-200μl 冰冷的试剂B 稀释下层膜蛋白部分，混匀后冰浴2min，37℃水浴5-10 分钟，37℃下②1000g-2000g 力离心5 分钟，此时溶液分为两层（对着光线看），下层是膜蛋白约为20-50μl。
8. 按步骤 7 再次抽提膜蛋白(此步骤可以选做)。
9. 用 80-200μl 冷的试剂C 稀释下层膜蛋白部分，即得膜蛋白。
10. 将上述蛋白提取物定量④后分装于-80℃冰箱保存备用或直接用于下游实验⑤。
注：
① 细胞数量根据实验情况调整，每次的裂解液用量并不是一定的，请根据实际情况调整。由于膜蛋白含量较少，需要较多的细胞才能保证得率。
② 必需保证在37℃左右下离心，至少确保30℃以上。无可控温的离心机时，用常温的离心机在室温离心即可，适当缩短离心时间至2-3 分钟。
③ 进行下游实验时，可用试剂C 分别稀释上层和下层，取一个上层样品同时进行实验分析。
④ 用BCA 法进行蛋白定量。
⑤ 蛋白样品－80℃存放一年没有问题。注意不要被蛋白酶水解掉，不要被细菌污染。
B．组织蛋白提取
1. 取适量组织样本剪碎，加冷PBS，用组织匀浆器匀浆至无明显肉眼可见固体（或用液氮研磨），冰上静置5 分钟，小心将匀浆吸入另一预冷的干净离心管。
2. 在 4℃，500g 条件下离心2-3 分钟，弃上清。
3. 按照细胞蛋白的提取方法的第 3 步骤往下操作即可。
上述蛋白提取物请分装后于-80℃冰箱保存备用。
使用本产品发表的文献：
● Ge Zhao, Siyuan Li, Wei Zhao, et al. Phage Display against Corneal Epithelial Cells
Produced Bioactive Peptides That Inhibit Aspergillus Adhesion to the Corneas
PLoS ONE March 2012 | Volume 7 | Issue 3, （IF=4.411）
● Shunming Zhu, Fei Sun, et al. Apelin stimulates glucose uptake through the PI3K/Akt
pathway and improves insulin resistance in 3T3-L1 adipocytes
Molecular and Cellular Biochemistry 2011 Volume 353, Numbers 1-2, （IF=2.168）
● LIAO, LIHONG, et al. The Influence of Down-Regulation of Suppressor of Cellular Signaling
Proteins by RNAi on Glucose Transport of Intrauterine Growth Retardation Rats
Pediatric Research 2011 Volume 69, Issue 6, pp 497-503 （IF=2.803）
