产品说明
本公司生产的SuperLightTM荧光素酶报告基因检测法是采用荧光素和ATP作为底物，对哺乳动物、酵母或大肠杆菌细胞中的荧光素酶表达进行定量测定。该反应会产生光，因此可用光度计方便地测量。
反应式：
荧光素酶
ATP+D-荧光素+ O2 氧化荧光素+ AMP + PPi + CO2 + 光
这种生物发光报告基因检测法极其敏感，尤其适用于定量测定重组细胞中的荧光素酶表达水平。这种基于细胞的超敏匀相检测法只需加入一种工作液，在短暂的培养步骤（2分钟）后即可测定荧光强度。可在试管、比色皿或多孔板中完成该检测。试剂盒中的所有试剂都与培养液及所有液体处理系统兼容。由于发射荧光动力学持续时间较长（半衰期40分钟），因此该检测法尤其适合在96孔板、384孔板和1536孔板中进行高通量筛选。试剂盒中提供的试剂配比恰当, 提高了检测的敏感性、可重复性并延长保质期。该试剂盒的适用范围包括基因调节研究和高通量筛选基因调节剂。
产品特点
敏感性高、检测范围广：低至2 fg的荧光素酶及4个细胞的定量分析。及至7个数量级的线性范围。
兼容常规实验室检测及高通量筛选：可在试管或微孔板中采用LJL分析仪、Berthold光度计、Top-Count、MicroBeta计数器、化学发光成像分析仪（CLIPR/LeadSeeker）完成该检测。检测试剂与所有液体处理系统兼容。
快速、简单：“混合-测量”型匀相检测，可在10分钟内完成对荧光素酶水平的检测。优化后的试剂组合只需一次添加步骤，同时完成细胞溶解和检测程序。
稳定、适合高通量筛选：在96孔板和384孔板中观察到Z’系数为0.6至0.8。采用高通量筛选液体处理系统该检测易于自动化。
适用范围
基因调控: 评判基因表达水平、启动子活性、以及受体、转录因子和小分子对基因表达的调节。
药物研发：高通量筛选基因调节剂。
试剂盒组成
| 产品编号 | 数量（检测份数） | 试剂 | 缓冲液 | | SLLU-200 | 200 | 固体 | 20 mL | | SLLU-500 | 500 | 固体 | 50 mL | | SLLU-01K | 1,000 | 固体 | 100 mL | | SLLU-HTS | > 5,000 | 固体 | 适量 |
储存条件：试剂在-20°C 下保存于棕色瓶内。缓冲液在2-8°C下保存。
检测说明书： 可在www.bioassaysys.com上在线下载。
预防措施：本产品仅供研究用。使用过程中应严格遵循实验安全措施。
检测步骤
SuperLightTM 荧光素酶报告基因检测是基于荧光素/荧光素酶反应过程中会产生荧光的原理。优化后的试剂配制可将细胞溶解和检测合并到一个步骤完成。培养液中的酚红并不干扰检测结果。技术要点中的所有数据都是在含有酚红的培养液中测得的。
注：虽然用缓冲液配好的试剂可在-20 °C下保存4周，但仍建议现配现用。
96孔板测定步骤：
1. 在白色不透明的96孔组织培养板中培养细胞（80 mL）。培养液含DMEM、10%胎牛血清和抗生素（青霉素/链霉素、庆大霉素等）。氨基酸和其它营养物也可加入到培养液中。不论是粘附细胞还是悬浮细胞，都可进行检测。可从稳定或瞬时转染细胞中检测荧光素酶基因。尽管本方案中使用80 mL，但培养体积可从50至100mL之间不等。还应准备不含细胞的空白对照孔。
2. 向细胞中加入待测化合物和对照品。混匀，培养至所需的时间。对于基因调节研究，培养时间可从数小时至3天之间不等。建议一式两份或一式三份进行检测。建议将20 mL体积的待测化合物溶解到PBS溶液或培养液中。
3. 配制试剂。首先将试剂和缓冲液放置至室温，然后用吸液器移取少量（如 1 mL）缓冲液至装有试剂的试管中。轻轻振荡试管，将配制好的溶液移至装有缓冲液的瓶内。重复以上步骤直至将所有试剂都移至装有缓冲液的瓶内。翻转试剂瓶使其混合，直到试剂完全溶解。完成上述步骤后，将试剂瓶标注为已配试剂。
4. 将100 mL 配好的试剂（每80 mL细胞培养液）加入到各孔中，与细胞混匀。室温下培养2分钟。可根据细胞培养液的体积调整所加试剂的体积。
5. 用光度计测量荧光强度。根据荧光素酶的表达水平和仪器的敏感度，积分时间可在1秒至2分钟之间不等。对于大多数光度计（Berthold 光度计、LJL 分析仪、Top Count、MicroBeta 计数器、CLIPR 和LeadSeeker）， 积分1至5秒较为恰当。
384孔板测定步骤：
1. 在白色不透明的384孔组织培养板中培养细胞（25 mL）。尽管本方案中使用25 mL，但培养体积可从20至50mL之间不等。准备不含细胞的空白对照孔。
2. 向细胞中加入待测化合物和对照品。混匀，培养至所需的时间。建议将5 mL体积的待测化合物加入到PBS溶液或培养液中。
3. 试剂配制步骤同96孔板检测。
4. 将30mL 配好的试剂（每25mL细胞培养液）加入到各孔中，与细胞混匀。室温下培养2分钟。可根据细胞培养液的体积调整所加试剂的体积。
5. 用光度计测量荧光强度。根据荧光素酶的表达水平和仪器的敏感度，积分时间可在1秒至2分钟之间不等。对于大多数光
度计（Berthold 光度计、LJL 分析仪、Top Count、MicroBeta 计数器、CLIPR 和LeadSeeker），积分1至5秒较为恰当。
总则
培养时间：荧光素/荧光素酶反应及细胞溶解的过程都很快，所以加入试剂后培养2至10分钟对于哺乳动物细胞（如 HEK293，CHO）来说是足够的。
细胞数量：优化后的报告基因检测试剂对荧光素酶非常敏感（低至2 fg），且线性范围达7个数量级。可测定低至4个细胞，并且当96孔板的每个孔中有多达80,000个细胞时仍可观察到线性相应关系。为了优化检测，建议根据细胞连续稀释来确定每孔的最佳细胞数量。细胞可以是粘附细胞或悬浮细胞。
细胞溶解与混合：为了操作方便，将1份配好的试剂加入到1份细胞中可确保混合充分。由于试剂盒特别配备的缓冲液可立刻溶解哺乳动物细胞，因此无需其它混合步骤。
数据分析
荧光强度（RLU）直接与荧光素酶的浓度成正比。对于剂量反应研究，可绘制检测数据与化合物浓度的曲线。也可采用Prism 或其他数据分析工具通过非线性回归分析确定EC50（基因正向调节化合物）和IC50（基因负向调节化合物）。
参考文献- Zhao, L. and Haslam, D.B. (2005). A quantitative and highly sensitive luciferase-based assay for bacterial toxins that inhibit protein synthesis. J Med Microbiol 54:1023–1030.
- Saenz JB, Doggett TA, and Haslam (2007). Identification and characterization of small molecules that inhibit intracellular toxin transport. Infection and Immunity 75(9): 4552–4561.
- Gentry, M. et al. (2007). Role of primary human alveolar epithelial cells in host defense against Francisella tularensis Infection. Infection and Immunity 75(8): 3969-3978.
- Michael, K. et al. (2007). Microplate orbital mixing improves high-throughput cell-based reporter assay readout. J Biomol Screen 12(1):140-144.
技术要点
本公司生产的SuperLightTM 荧光素酶报告基因测试盒经特殊优化处理，且配比恰当，对于在哺乳动物细胞中开展基因表达和调节研究，这是一种敏感、方便且稳健的检测方法。该试剂盒的主要特点如下：
敏感性高且检测范围广：能定量低至2 fg的荧光素酶及4个细胞。7个数量级的线性范围。
与常规实验室检查兼容且具有高通量筛选模式：可在试管或微孔板中采用LJL分析仪、Berthold光度计、Top-Count、MicroBeta计数器、化学发光成像板分析仪（CLIPR/LeadSeeker）完成该检测。检测试剂与所有液体处理系统兼容。
快速且简单：“混合-测量”型匀相检测，可在10分钟内完成对荧光素酶水平的检测。优化后的组合试剂系统只需一次添加步骤，同时完成细胞溶解和检测程序。
稳健且适合高通量筛选：在96孔板和384孔板中观察到Z’系数为0.7至0.9。采用高通量筛选液体处理系统该检测易于自动化。
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图1. SuperLightTM荧光素酶检测在384孔板中得到的线性结果。根据空白对照品，估计检测限大约为2 fg。荧光强度在2 fg - 46 ng的范围内呈线性变化。
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图2. 在384孔板检测中，所发射得荧光强度与经CRE-荧光素酶报告基因瞬时转染的HEK293细胞数量之间呈线性关系。检测限： 4个细胞。
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图3. 在经CRE-荧光素酶瞬时转染的HEK293细胞中，前列腺素E2（PGE2）和腺苷酸环化酶激活剂毛喉素对CRE依赖性荧光素酶表达水平的正向调节作用。PGE2的EC50 = 0.15 mM；毛喉素的EC50 = 3.5 mM。 |
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