动物细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒

(Animal Nuclear and Cytoplasmic Protein Extraction Kit)

● 产品简介

在研究细胞时经常要研究细胞的不同组份，而研究得最多的两个细胞组份就是细胞核和细胞浆。分离细胞核蛋白和细胞浆蛋白，不仅可以用于研究蛋白在细胞内的定位，而且很多时候分离出来的核蛋白可以用于转录调控方面的研究，例如EMSA(也称gel shift)，footprinting等。细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒(Nuclear and Cytoplasmic Protein Extraction Kit)提供了一种比较简单方便地从培养细胞或新鲜组织中抽提细胞核蛋白与细胞浆蛋白的方法。约90分钟就可以完成培养细胞的细胞核蛋白与细胞浆蛋白的分离。抽提得到的蛋白可以用于Western，EMSA，footprinting，报告基因检测以及酶活力测定等后续操作。

本试剂盒是通过细胞浆蛋白抽提试剂A和B，在低渗透压条件下，使细胞充分膨胀，然后破坏细胞膜，释放出细胞浆蛋白，然后通过离心得到细胞核沉淀。最后通过高盐的细胞核蛋白抽提试剂抽提得到细胞核蛋白。一般情况下，胞浆蛋白与核蛋白之间的交叉污染在10%左右，基因组DNA/mRNA 的干扰均降到了最低。

对于细胞样品，如果每个样品的数量不超过二百万个细胞（细胞沉淀体积PCV 20 μl），本试剂盒可以抽提50个样品；对于组织样品，如果每个样品的重量不超过20毫克，本试剂盒可以抽提50个样品。

● 产品组成

●  贮存条件和运输：

-20℃贮存，一年有效；试剂盒湿冰运输。

●  使用方法：

一 培养细胞蛋白提取：

1.1 准备溶液：常温融解试剂盒中的试剂，溶解后立即放置在冰上，混匀。取适当量的细胞浆蛋白抽提试剂A和细胞核蛋白抽提试剂，在使用前数分钟内加入1/100体积的PMSF（100×）和1/1000体积的1 M DTT，随后立即放于冰上待用。

1.2 准备细胞：

1.2.1 对于贴壁细胞：用1×PBS洗一遍，用细胞刮刀刮下细胞，或用0.02% EDTA溶液处理细胞使细胞不再贴壁很紧，并用移液器吹打下细胞。2000 g离心收集细胞，尽最大努力吸尽上清，留下细胞沉淀备用。尽量避免用胰酶消化细胞，以免胰酶降解需抽提的目的蛋白。

1.2.2 对于悬浮细胞：2000 g离心收集细胞，用1×PBS洗一遍，离心收集细胞，尽最大努力吸尽上清，留下细胞沉淀备用。

1.3 按照下表加入各种试剂体积：

注：2×106(二百万)HeLa细胞，其细胞沉淀体积（PCM，Packed Cell Volume）大约为20 μl。

1.4 胞浆蛋白提取：

1.4.1细胞沉淀中加入准备好的细胞浆蛋白抽提试剂A（含PMSF和DTT），用移液器吹打重悬细胞沉淀，随后涡旋震荡5秒，把细胞沉淀完全悬浮并分散开,冰浴15分钟。

        注：此步骤涡旋震荡无需太剧烈，否则得到的细胞浆蛋白可能会污染核蛋白。

注：离心前，可以用台盼蓝染色观察细胞裂解情况。加入抽提试剂B后，细胞膜完全破裂，胞浆完全释放，但细胞核保持完整。镜检下可以看到完全染成蓝色的细胞核。

1.4.3 立即吸取上清至一预冷的离心管中，即为抽提得到的细胞浆蛋白。可以立即使用，也可以冻存。

注：吸取上清时千万不要触及沉淀，可以在沉淀上方保留极小体积的上清，以免触及沉淀。每200万细胞用200 μl细胞浆蛋白抽提试剂A裂解后可获得的上清，其细胞浆蛋白浓度约为2-5 mg/ml，不同细胞略有不同。

1.5 细胞核蛋白提取：

1.5.1 可选步骤：沉淀中加入200 μl 1×PBS，彻底重悬后，4℃ 16000g 离心5分钟，完全吸尽残余的上清，保留沉淀。

注：此步骤的漂洗可以减轻胞浆蛋白的交叉污染。

1.5.2 对于沉淀，用10 μl吸头完全吸尽残余的上清，加入细胞核蛋白抽提试剂（含PMSF和DTT）。

1.5.3重悬沉淀，随后最高速剧烈震荡15秒，把细胞沉淀完全悬浮并分散开，冰浴孵育40分钟，期间每隔10分钟高速剧烈震荡15秒。

注：此步骤必须高速剧烈震荡，否则会导致细胞核蛋白提取得率大大降低。

1.5.4 4℃16,000g离心5分钟，立即吸取上清至一预冷的离心管中，即为抽提得到的细胞核蛋白。可以立即使用，也可以-70℃冻存。每200万细胞用100微升细胞核蛋白抽提试剂裂解后获得的上清，其细胞核蛋白浓度约为1.2-3 mg/ml，不同细胞略有不同。

二 新鲜组织蛋白提取：

2.1 准备溶液：常温融解试剂盒中的试剂，溶解后立即放置在冰上，混匀。取适当量的细胞浆蛋白抽提试剂A和细胞核蛋白抽提试剂，在使用前数分钟内加入1/100体积的PMSF（100×）和1/1000体积的1 M DTT，随后立即放于冰上待用。

2.2准备组织：

手术切除组织块，迅速置于预冷的1×PBS 中，漂洗数次，滤纸吸干水分，将组织切成细小的组织块，称重组织，按照下表加入各试剂的量

2.3 胞浆蛋白提取：

加入细胞浆蛋白抽提试剂A和细胞浆蛋白抽提试剂B，在匀浆器中匀浆，直至获得均匀的悬浮液，或者使用27#针头，用注射器抽打裂解液5次；将匀浆液转移到预冷的离心管内，冰浴放置15 分钟。

注：匀浆后可以用台盼蓝染色观察细胞裂解情况。加入抽提试剂A和抽提试剂B后，细胞膜完全破裂，胞浆完全释放，但细胞核保持完整。镜检下可以看到完全染成蓝色的细胞核。

2.4 4℃ 16,000 g 离心5分钟，把上清转移至一预冷的离心管中，为抽提得到的细胞浆蛋白。注：吸取上清时千万不要触及沉淀，可以在沉淀上方保留极小体积的上清，以免触及沉淀。

2.5 细胞核蛋白提取：

2.5.1 可选步骤：沉淀中加入200 μl 1×PBS，彻底重悬后，4℃ 16000g 离心5分钟，完全吸尽残余的上清，保留沉淀。

注：此步骤的漂洗可以减轻胞浆蛋白的交叉污染。

2.5.2 对于沉淀，用10 μl吸头完全吸尽残余的上清，加入细胞核蛋白抽提试剂（含PMSF和DTT）。

2.5.3重悬沉淀，随后最高速剧烈震荡15秒，把细胞沉淀完全悬浮并分散开，冰浴孵育40分钟，期间每隔10分钟高速剧烈震荡15秒。

注：此步骤必须高速剧烈震荡，否则会导致细胞核蛋白提取得率大大降低。

2.5.4 4℃16,000g离心5分钟，立即吸取上清至一预冷的离心管中，即为抽提得到的细胞核蛋白。可以立即使用，也可以-70oC冻存。

注：一般常规提取的蛋白样品，进行后续试验不需要透析，但如果需要较大量的提取蛋白或后续试验结果不理想，则需要将提取的核蛋白进行透析脱盐。

三 实验示例：

 Jurkat总蛋白，细胞浆蛋白，细胞核蛋白GAPDH检测

总蛋白提取：4×106 Jurkat细胞，2000 g 离心收集，去上清，沉淀中加入200 μl RIPA（加2 μl 100 mM PMSF），冰上裂解5分钟，4℃ 16000 g 15 分钟，上清即为总蛋白（TP）。

细胞浆蛋白：4×106 Jurkat细胞，2000 g 离心收集，加入400 μl细胞浆蛋白抽提试剂A（加4 μl 100mM PMSF，加0.4 μl 1 M DTT），悬浮沉淀，冰浴15分钟；加入20 μl细胞浆蛋白抽提试剂B，混匀，冰上孵育1分钟，震荡5秒，4℃ 16000g 10分钟，小心收集上清即为细胞浆蛋白（C-Pr），不要触及沉淀。

细胞核蛋白提取：沉淀用200 μl 1×PBS漂洗一次，4℃ 16000 g 2分钟；沉淀中加入200 μl 细胞核蛋白抽提试剂（加2 μl 100mM PMSF，加0.2 μl 1 M DTT），重悬沉淀，剧烈震荡15秒，冰浴40分钟，每间隔10分钟剧烈震荡15秒；4℃ 16000 g 5分钟，上清即为细胞核蛋白（N-Pr）。

电泳：RTD6132-15%3.3C  200V 33-12 mA 55 min

转膜：NC膜，1×RealBlot快速转膜液湿转，稳流400 mA，电压变化64-57 V，转膜时间35 min

封闭：无蛋白快速封闭液RT 20 min

一抗孵育：GAPDH 羊抗兔多抗，一抗稀释液稀释1：2000

二抗孵育：羊抗兔IgG-HRP，二抗稀释液稀释1：5000

检测：ECL发光检测