| 规格编号 | 规格 | 库存 | 价格 |
|---|---|---|---|
| RTD6140 | 10次 | 100 | 800 |
| 规格 | 10次 |
| 数量 | 100 |
Blue/Clear 非变性凝胶电泳试剂盒（手灌胶）
Blue/Clear Native PAGE Electrophoresis Kit Ver.731072
货号 | 名称 | 包装 |
RTD6140 | Blue/Clear 非变性凝胶电泳试剂盒(手灌胶) | 10 次 |
● 货品内容：
组份 | 货号 | 名称 | 规格 | 保存 |
1 | RTD6140-01 | 2×BN/CN凝胶缓冲液 | 40 ml | 4℃ |
2 | AC2914-30ml | 40% PAA（29:1） | 30 ml | 4℃ |
2 | BC500P | 10×BN/CN PAGE电泳缓冲液(干粉) | 500 ml | RT |
3 | PL114-01 | 4×BN/CN-PAGE蛋白上样缓冲液 | 1 ml | -20℃ |
4 | BC250 | 0.4% G-250染料（电泳用） | 100 ml | 4℃ |
5 | BC260-01 | 5% G-250染料（上样用） | 1 ml | 4℃ |
6 | SR0510 | 浓缩胶红色添加染料(200×) | 0.5 ml | RT |
7 | AP020P | APS（干粉） | 0.5 g | RT(配制后-20℃贮存) |
8 | TA0761 | TEMED | 0.5 ml | 4℃ 避光 |
9 | 说明书 | 一份 |
● 产品简介：
Blue/Clear Native PAGE（BN/CN-PAGE）是一种从生物样品（质膜，胞浆等）中分离分子量10 kD-10 M kD 范围的蛋白质复合物的电泳技术。其原理是用温和去污剂(如 DDM，digitonin)将蛋白复合体从细胞膜中以近似天然的状态分离出来，Blue Native PAGE （BN-PAGE）是用考马斯亮蓝 G-250 代替 SDS与蛋白结合而使其带负电荷，根据蛋白分子量不同在 PAGE胶中得到分离；Clear Native PAGE（CN-PAGE）是电泳缓冲液中不加入任何染料，电泳中始终保持蛋白的天然电荷和活性状态，然而，其蛋白的分辨率要低于Blue Native PAGE。另外，BN-PAGE由于考马斯亮蓝G-250存在，使蛋白都覆盖上负电荷，可以分离碱性蛋白（pI＞7）和酸性蛋白(pI＜7)；而CN-PAGE只适合于酸性蛋白（pI＜7）的分离。
本产品包括BN/CN-PAGE制胶的所有成分，方便使用。可以用于分离分子量在 10 kD-500 kD 的蛋白复合体，样品可以来于胞浆、细胞总裂解液、细胞膜、线粒体膜和叶绿体膜等。电泳后可直接用于考染、银染、Western 杂交、SDS-PAGE电泳、蛋白纯化、蛋白活性检测等分析实验，也可直接用于电洗脱制备蛋白。
试剂盒配套有红色浓缩胶添加染料,凝固后的浓缩胶为红色,有利于在蓝色电泳缓冲液中观察加样孔,方便上样。
本试剂盒大约可以配制8-25块常规大小（8×10 cm）PAGE凝胶，具体数量根据凝胶浓度和厚度决定，1 mm厚度8%凝胶可以配制至少10块胶。
● 运输和贮存：
本产品常温运输；组份按照标签温度贮存；有效期一年。
● 使用说明：
一. 样品制备：
该试剂盒不含样品制备的相关试剂，根据样品种类，具体选择不同提取方法。植物类囊体BN样品制备可以选择植物类囊体膜提取试剂盒（货号：RTU5002）；动物总蛋白BN样品制备可以选择动物胞浆活性蛋白提取试剂盒（不含去垢剂，离心柱法）（货号：RTD8106）；动物膜蛋白BN样品制备可以选择动物膜蛋白提取试剂盒(细胞)（货号：RTD8111）和动物膜蛋白提取试剂盒(组织)（货号：RTD8112）；动物线粒体BN样品制备可以选择动物细胞线粒体提取试剂盒（货号：RTD8115）和动物组织线粒体提取试剂盒（货号：RTD8117）。
二. 制胶：
2.1 分离胶制备：
2.1.1 不同浓度的分离胶的最佳分离范围：
分离胶浓度 | 最佳分离范围 |
6% | 80-500 kD |
8% | 50-350 kD |
10% | 20-150 kD |
12% | 15-100 kD |
15% | 10-80 kD |
2.1.2根据表一，将不同体积的成分在小烧杯中混合，轻轻搅拌使其混匀，避免产生气泡
2.1.3在凝胶模具中灌入适量分离胶溶液（对于mini-gel，凝胶液加至约距前玻璃板顶端1.5 cm或距梳齿约0.5 cm即可），然后在分离胶溶液上轻轻覆盖一层1-3 cm的水层，使凝胶表面保持平整。
2.1.4静置15-30分钟，待分离胶和水层之间出现一个清晰的界面后，说明凝胶已聚合。
注：凝胶的聚合时间与环境温度有关。夏天温度较高时，聚合较快；冬天气温低时，聚合时间会延长。可以根据环境温度的不同调节APS的加入量。
表一 Blue/Clear Native PAGE分离胶配方表
（以一块1.0 mm厚度mini胶为例）
分离胶总体积 5 ml | |||||
6% | 8% | 10% | 12% | 15% | |
组份 | 组份加入体积（ml） | ||||
灭菌水 | 1.7 | 1.45 | 1.2 | 0.95 | 0.57 |
2×BN/CN凝胶缓冲液 | 2.5 | 2.5 | 2.5 | 2.5 | 2.5 |
40％ PAA（29:1） | 0.75 | 1 | 1.25 | 1.5 | 1.875 |
10％ APS | 0.05 | 0.05 | 0.05 | 0.05 | 0.05 |
TEMED | 0.005 | 0.005 | 0.005 | 0.005 | 0.005 |
2.2 浓缩胶制备：
2.2.1去除覆盖在分离胶上的水层。
2.2.2按照表二将不同成分在一个小烧杯中混合，轻轻搅拌使其混匀，避免产生气泡。
2.2.3将浓缩胶溶液加至分离胶的上面，直至凝胶溶液到达前玻璃板的顶端。
2.2.4将梳子插入凝胶内，避免产生气泡。
2.2.5静置30-60分钟，等待浓缩胶聚合。
注：凝胶的聚合时间与环境温度有关。夏天温度较高时，聚合较快；冬天气温低时，聚合时间会延长。可以根据环境温度的不同调节APS的加入量。
表二 Blue/Clear Native PAGE浓缩胶（4%）配方表（以一块1.0mm厚度mini胶为例）
组份 | 不同凝胶体积对应各组份的取样量 |
浓缩胶总体积2 ml | |
H2O | 0.8 ml |
2×BN/CN凝胶缓冲液 | 1 ml |
40％ PAA（29:1） | 0.2 ml |
浓缩胶红色添加染料(200×) | 10 μl |
10％ APS | 20 μl |
TEMED | 2 μl |
三. 电泳：
3.1 准备电泳缓冲液：
将10×BN/CN PAGE电泳缓冲液（干粉）溶于500 ml灭菌水中，彻底溶解，测定pH应为7.0左右，不要调节pH。用前稀释10倍即配成1×BN/CN PAGE电泳缓冲液。
3.1.1 CN-PAGE电泳：
阳极缓冲液和阴极缓冲液均直接使用1×BN/CN PAGE电泳缓冲液进行电泳。
3.1.2 BN-PAGE电泳：
阳极缓冲液(外槽)使用1×BN/CN PAGE电泳缓冲液，阴极缓冲液(内槽)按照下表配制：
| 1×蓝色阴极缓冲液 |
| 150 ml |
10×BN/CN PAGE电泳缓冲液 | 15 ml |
0.4% G-250 染料（电泳用） | 0.75 ml |
超纯水 | 定容至150 ml |
3.2 准备样品：
3.2.1 CN-PAGE电泳：
总体积 | 10 μl |
蛋白样品 | x μl |
4×BN/CN-PAGE蛋白上样缓冲液 | 2.5 μl |
超纯水 | 补至10 μl |
| 不要加热 |
3.2.2 BN-PAGE电泳：
3.2.2.1 含去垢剂样品（以植物类囊体膜蛋白电泳为例）：
总体积 | 10 μl |
植物类囊体膜蛋白样品（DDM增溶） | x μl |
4×BN/CN-PAGE蛋白上样缓冲液 | 2.5 μl |
5% G-250染料（蛋白上样） | 0.25-1 μl |
超纯水 | 补至10 μl |
| 不要加热 |
* 含去垢剂样品中染料加入按照以下原则：
样品中G250终浓度为去垢剂终浓度的1/4（质量比）。例如样品中DDM终浓度为1%，则需要G-250终浓度为0.25%。10 μl蛋白样品中需要加5% G-250染料0.5 μl。
3.2.2.2 不含去垢剂样品：
总体积 | 10 μl |
不含去垢剂样品 | x μl |
4×BN/CN-PAGE蛋白上样缓冲液 | 2.5 μl |
5% G-250染料（蛋白上样） | - # |
超纯水 | 补至10 μl |
| 不要加热 |
# 不含去垢剂样品可以不必添加5%G-250染料。
3.3电泳过程；3.3.1 CN-PAGE电泳：
电泳内外槽均使用1×BN/CN PAGE电泳缓冲液。在电泳槽的内槽内加入1×BN/CN PAGE电泳缓冲液(让电泳缓冲液漫过加样孔)，轻轻拨出预制胶梳子，用1ml吸头冲洗加样孔3次，随后在电泳槽外槽加入适量的1×BN/CN PAGE电泳缓冲液。
CN-PAGE电泳 | |||
恒电压 | 起始电流 | 结束电流 | 电泳时间 |
120V | 10-15mA/板胶 | 4-10mA/板胶 | 50+min |
注：冰浴电泳 | |||
3.3.2 BN-PAGE电泳：
BN-PAGE电泳外槽使用1×BN/CN电泳缓冲液；内槽开始电泳使用的是1×蓝色阴极缓冲液，冰浴电泳，等待电泳指示前沿到达距离凝胶顶部2/3处时，将电泳缓冲液更换为1×BN/CN电泳缓冲液，继续后续电泳，因为过多染料会影响蛋白在凝胶中的迁移以及蛋白后续的转膜实验。
BN-PAGE电泳条件（一板胶）
恒电压 | 起始电流 | 电泳时间 | 缓冲液 |
|
120 V | 8-15 mA | 20-25 min | 1×蓝色阴极缓冲液 | 冰浴电泳 |
指示前沿至凝胶顶部三分之二处，更换内槽缓冲液为无色1×BN/CN 电泳缓冲液
|
恒电压 | 继续电泳时间 | 结束电流 | 缓冲液 |
|
120 V | 45 min + | 3-5 mA | 1×BN/CN电泳缓冲液 | 冰浴电泳 |
四. 转膜：
BN-PAGE转膜必须用PVDF膜，不能用NC膜，因为NC膜与G-250结合非常紧密。
转膜缓冲液可以使用10×BN转膜缓冲液（货号：BC600P）。
五. 染色：
5.1 将电泳后的PAGE胶取下放入塑料容器中，加入适量FastBlue蛋白染色液（以刚刚覆盖过胶面为适），条带1-2分钟即可见。
5.2 摇床常温摇动10-15分钟至条带清晰可见。
5.3 加入适量蒸馏水脱色，期间更换1-2次蒸馏水，摇床常温摇动10-15分钟至背景干净。
5.4 观察保存结果。
六. 实验示例：
RTD6140 Blue/Clear 非变性凝胶电泳试剂盒（手灌胶） WB检测
样品处理：K562悬浮细胞提取胞浆活性蛋白（货号：RTD6106 动物活性蛋白提取试剂盒（不含去垢剂））
4×BN/CN-PAGE蛋白上样缓冲液（货号：PL114） 调整蛋白浓度为1μg/μl上样液，梯度上样5-20μg
电泳：8% BN手灌胶，稳压200V 1×蓝色阴极缓冲液至指示前沿距离胶上沿2/3处，
更换为无色1×BN/CN PAGE电泳缓冲液，电泳时间共83分钟
转膜：0.45 μm PVDF膜，10×BN转膜缓冲液（货号：BC600P）稀释为1×BN转膜缓冲液加20%甲醇，
恒流200mA 2小时，未冰浴。
转膜效果检测：膜用丽春红染色液染色（货号：RTD6301）有可见条带，胶用FastBlue蛋白染色液染色
（货号：RTD6202）几乎无条带，证明转膜成功。膜用无水甲醇清洗5分钟去除膜上蓝色残余。
封闭：Western快速封闭液（货号：WR5020） RT 封闭10 分钟；
一抗：兔单抗GAPDH 1:10000 RT 60min；二抗：羊抗兔IgG-HRP 1:5000 RT 60min，
ECL检测：RealECL发光液（货号：EC2520），曝光1秒。
