Configuration-specific Monoclonal Antibody Based

RhoA Activation Assay Kit

Catalog Number：CR-W80601

20 assays

产品说明

   小 G 蛋白是从属于细胞调节因子中的一个超家族。Rho 家族是小 G 蛋白中的一个亚家族，它在细胞运动、细胞分裂以及基因转录中发挥主要作用。而本试剂盒中的 RhoA 就属于Rho 亚家族中的一种， RhoA 参与生理活动过程中其分子结构会呈现出 2 种相互转换的形式：与 GTP 结合的激活状态和与 GDP 结合的非活性状态。

   目前RhoA蛋白活性的检测主要是依据小GTP酶RhoA可以与RhoA效应蛋白(Rhotekin)的 RBD 区域结合，使 RhoA 效应蛋白活化从而发挥生物学功能，进而间接的进行 RhoA 活性功能的监测。然而此方法在检测过程中存在着一定的局限性比如 GTP 水解成 GDP 的速度过快以及 RhoA-GTP 结合蛋白与 RBD 结合区域之间较低的亲和力，导致这种检测方法的重复性较差。

  而科博瑞（武汉）生物科技有限公司推出的 RhoA 活性检测试剂盒主要是依据单克隆抗体能够特异性的识别特殊构象的 RhoA-GTP 结合蛋白，而不识别 RhoA-GDP 结合蛋白，进而简单并且快速的进行 RhoA 的活性检测。同时试剂盒中的 RhoA-GTP 单克隆抗体也可以进行免疫组化实验中细胞和组织中 RhoA 的活性监测。每套试剂盒可以进行 20 次检测。检测原理

   科博瑞（武汉）生物科技有限公司的 RhoA 活性检测试剂盒主要是利用识别蛋白特异构象的 RhoA-GTP 单克隆抗体特异性的去检测细胞提取物或者体外的（样品需要进行 GTPγS 活化处理）活性 RhoA-GTP 的水平。简言之，特异性识别 RhoA 活化构象的鼠单克隆抗体可以特异性结合细胞裂解液中的 RhoA-GTP 活性蛋白，然后利用 protein A/G 将抗原抗体的结合物吸附下来，再利用特异性识别 RhoA 活化构象的兔多克隆抗体进行免疫印迹分析进行检测。

试剂盒成分

1. 特异性识别 RhoA 活性构象的鼠单克隆抗体（Anti active RhoA, Mouse Monoclonal  Antibody (Catalog No. 26904)）：小管装--30ul (抗体浓度是 1mg/ml)，抗体溶于 PBS（pH7.4）并包含 50%的甘油和 0.05%的叠氮化钠。此抗体可以特异性识别所有脊椎动物中的  RhoA-GTP。

2. Protein A/G agarose (Catalog No. 30301) ：小管装—400ul 包含 200ul Protein A/G agarose和 200ul 20%乙醇溶液。（使用时溶液需要充分混匀，再吸取）

3. 5X Assay/Lysis Buffer (Catalog No. 30303)：小瓶装—30mL 包含 250 mMTris-HCl (pH8.0),750 mM NaCl, 50 mM MgCl2, 5 mM EDTA, 5% Triton X-100。

4. 特异性识别 RhoA 活性构象的兔多克隆抗体（Anti RhoA, Rabbit Polyclonal Antibody

   (Catalog No.21009)）：小管装--30ul (抗体浓度是 1mg/ml)，抗体溶于 PBS（pH 7.4包含有 50%的甘油。

5. 100 X GTPγS (Catalog No. 30302) ：小管装—100ul (10 mM) ，实验中 0.5mL 细胞裂解液使用 5ul GTPγS 标记。

6. 100 X GDP (Catalog No. 30304) ：小管装—100ul (100 mM) ，实验中 0.5mL 细胞裂解液使用 5ul GDP 标记。

储存条件

试剂盒的成分在试剂盒的有效期限内必须存放于 4°C 条件下保存。

试剂（试剂盒内不提供，由实验者自行配置）

1. 刺激和未刺激的细胞裂解物；

2. 蛋白酶抑制剂；

3. 4 °C 摇杆或者摇床；

4. 0.5 M EDTA (pH 8.0)；

5. 1 M MgCl2；

6. 2X reducing SDS-PAGE sample buffer；

7. 电泳和免疫印迹相关试剂；

8. 免疫印迹缓冲液 TBST (10 mM Tris-HCl, pH 7.4, 0.15 M NaCl, 0.05%Tween-20)；

9. 免疫印迹封闭缓冲液 (TBST containing 5% 脱脂奶粉 or 3% BSA)；

10. PVDF 或硝酸纤维素膜；

11. 二抗；

12. ECL 检测试剂；

试剂制备

1X Assay/Lysis Buffer：实验前用去离子水将 5X 的 Assay/Lysis 缓冲液稀释成 1X 的缓冲液，

并在使用前加入蛋白酶抑制剂如 1 mM PMSF, 10 µg/mL leupeptin（亮肽素），或 10 µg/mLaprotinin（抑肽酶）。