质粒小提试剂盒说明书
（Rev.A）

货号	规格	储藏/有效期
PD6204-5T	5T（试用装）	室温/一年
PD6204-50T	50T	室温/一年
PD6204-200T	200T	室温/一年

产品介绍
本试剂盒采用改进的SDS碱裂解法，结合DNA制备膜选择性地吸附DNA的方法达到快速纯化质粒DNA的目的。适合于从1-5 ml细菌培养物中提取多至20 μg高纯的质粒DNA，用于测序、体外转录与翻译、限制性内切酶消化、细菌转化等分子生物学实验。

试剂盒组成

组成	PD6204-5T	PD6204-50T	PD6204-200T
Buffer A	1.5 ml	15 ml	80 ml
Buffer B	1.5 ml	15 ml	80 ml
Buffer C	2.0 ml	20 ml	100 ml
Buffer WB	2.0 ml	15 ml	2×30 ml
Elution Buffer	1.5 ml	4 ml	20 ml
RNase	-	1支	1支
吸附柱P柱	5套	50套	200套
说明书	1 份	1 份	1 份

一、使用前准备
Buffer A：向提供的Buffer A中添加RNaseA后, 请将Buffer A置于4℃保存。
Buffer B、C：密封保存。Buffer C开盖后如果长时间未使用，请检查Buffer C的pH，确保pH≤4.5，如pH过高，可加入少量醋酸进行调节。
Buffer WB: 使用前请将6ml（5T包装）/ 60ml(50 T包装)/240ml（200T包装）无水乙醇加入 Buffer WB（试剂瓶上有标签提示）。

二、操作步骤
1. 接种菌种到1-5 ml 的液体培养基，37℃震荡培养12-16 h。室温下13,000 g离心1min，收集菌体，并尽可能的吸去上清。
注：残留的液体培养基容易导致菌液裂解不充分，第5步离心后沉淀较松，不能有效吸取上清。
注：本说明书中的操作程序适用于标准LB（Luria Bertani）培养基培养12-16 小时后，培养液OD₆₀₀（细菌密度）在2.0-3.0之间的菌液。若采用的是富集培养基，例如TB 或2×YT，请注意保证OD₆₀₀不超过3.0。
2. 加入250 µl Buffer A，用涡流震荡充分悬浮细菌细胞。
注：细菌细胞如果没有充分悬浮均匀，将导致菌体裂解不完全，从而降低产量。
3. 加入 250 µl Buffer B, 轻轻地颠倒混匀5-10 次以混合均匀，此时溶液粘稠而澄清。
注：切勿剧烈振荡。此步骤时间不超过5 min，时间过长会导致基因组DNA污染或质粒受到损伤。若溶液未清亮澄清，则表明菌体裂解不充分，应加大Buffer B的用量或减少菌体量。
4. 加入350 µl Buffer C, 颠倒混匀5-10次，此时出现白色絮状沉淀。

1. 将离心管转至高速离心机，在室温下13,000×g离心10 min（若上清中有白色沉淀漂浮，可再次离心）。小心吸取离心后的上清液。
2. （选做）如果质粒扩增菌株为BL21等高表达蛋白菌株，可向上清中加入300μl的异-丙-醇，上下颠倒混匀。
3. 将上一步得到的上清液添加至本试剂盒提供的吸附柱P柱中（如一次无法加完，可分多次加入，吸取时应避免吸起沉淀），室温下10,000 ×g离心1 min。弃掉收集管中的废液。
4. 加入700 μl 的Buffer WB溶液（确保已加入无水乙醇），室温下13,000×g离心1 min ，弃废液。重复此步骤。
5. 室温下13,000×g离心2 min以彻底甩下Buffer WB残留。
6. 取出吸附柱P柱并放入新的EP管中，将吸附柱P柱开盖室温下开盖静置2 min，如有需要可放在空调风口吹1-2 min，以彻底去除残留的乙醇。

1. 向吸附柱P柱正中间加入30-100 µl (推荐50μl的溶解体积)Elution Buffer或ddH₂O（56℃水浴后效果更好），静置5min待吸附的质粒完全溶解，室温下13,000×g离心2 min即得到提取的质粒。

注：提取到的质粒 DNA可直接用于基因克隆、测序、酶切、文库筛选、体外转录翻译、转染细胞。若用于转染内毒素敏感性细胞株，原代细胞及用于微注射，建议去除内毒素。

三、DNA浓度及纯度
DNA浓度(µg/ml) = OD₂₆₀ × 50× 稀释倍数，OD₂₆₀/ OD₂₈₀约为1.8-2.0

四、注意事项
质粒拷贝数:纯化中低拷贝的质粒时，使用2倍的菌液体积，2倍的Buffer A,B,C, 相同体积的Buffer WB和Elution Buffer。
转化菌:若为-80℃甘油冻存的菌，请先涂布平板培养后，再重新挑选新的单个菌落进行培养。
切勿直接取冻存的菌种进行培养。

五、常见问题及解答
1、没有提出质粒或者质粒浓度很低
A、菌种老化：
建议：对于甘油保存的菌种，需要先进行活化。涂布或者划线菌种，重新挑选单菌落进行液体培养，并对菌种进行初摇活化，按照1：500的比例进行菌种培养。二次培养细胞最好不要超过16小时。
B、质粒丢失
建议：某些质粒在多次继代培养的过程中会出现丢失的现象，另外检查筛选抗生素的浓度是否正确。
C、裂解不充分
建议：如果采用超过推荐量的菌体进行质粒制备，会导致菌体裂解不充分。可适当减少菌体的用量或者相应增大各种Buffer的用量。请根据选取的试剂盒，处理相应量的细菌量。
D、Buffer中有沉淀未溶解
建议：Buffer B和Buffer C在温度较低时会出现沉淀，使用前请检查是否有沉淀生成，如有沉淀生成，请置于37℃温育片刻，待溶液澄清后使用。


E、DNA Wash Buffer中未按要求加入乙醇
建议：按照说明书要求加入要求量的无水乙醇，使用后旋紧瓶盖，防止乙醇挥发。
F、溶解液pH值不正确
建议：将DNA从柱子上溶解下来的最适pH值在7.0~8.5之间，如果溶解液的pH超出此范围将会显著影响溶解效果，请使用试剂盒配套的Elution Buffer（pH 8.5，10 mM Tris-HCl）进行溶解，如果用ddH₂O或者其他溶液进行溶解，请确保pH在7.0~8.5之间。
G、溶解体积及时间的选择
建议：溶解体积将会影响最终的收获量，溶解体积越大，收获量越高，但是浓度将会降低。请使用试剂盒推荐的溶解体积进行溶解，以保证最好的收获量和浓度。如果需要高浓度的质粒，请减少溶解体积。另外，如果想收获高浓度高收获量的质粒，可进行二次溶解。
建议：加入Elution Buffer后，室温放置2~5 min，更有利于溶解。

2、质粒纯度不高
A、蛋白质污染OD₂₆₀/ OD₂₈₀<1.8
建议：选择推荐量的菌体，离心后小心吸取上清，如果上清液中混有悬浮物，可再次离心，以彻底去除蛋白质。
B、RNA污染OD₂₆₀/ OD₂₈₀>2.0
建议：检查配送的RNase A是否完全加入到Buffer A中，加入RNase后，Buffer A/RNase应该存放在4℃，如果存放时间过长，或者没有正确存放，请重新加入RNase。
C、基因组DNA污染
建议：加入Buffer B后，轻轻颠倒混匀，避免剧烈震荡涡旋，加入Buffer B的处理时间最好不要超过5 min。




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