Di-4-ANEPPDHQ (solution) 

Di-4-ANEPPDHQ (solution) is a polarity-sensitive membrane probe with a doubly positive charge that can be used to visualize membrane microdomains in living Arabidopsis cells. Di-4-ANEPPDHQ produces a fluorescence spectrum shift by changing the polarity of the lipid environment after embedding into the cell membrane, thereby quantifying the degree of lipid accumulation. The excitation wavelength of Di-4-ANEPPDHQ is 488 nm, and the emission wavelengths are 560 nm and 650 nm in the liquid ordered and disordered phases, respectively. Di-4-ANEPPDHQ is often used for fluorescence imaging studies of membrane microstructure, lipid order, and membrane tension response in living cells[1][2][3].
Solvent and concentration: DMSO: 5 mM

一、拟南芥 (Arabidopsis thaliana) 活细胞染色^[1]
步骤： 1. 样品准备：3 日龄拟南芥幼苗置于 1/2 MS 培养基中，取根毛及表皮细胞用于染色。
2. 染色操作：加入 5 μM Di-4-ANEPPDHQ (溶于 1/2 MS 培养基)，冰浴孵育 5 分钟，用冷 1/2 MS 培养基洗涤 1 分钟。
3. 质壁分离验证：用 650 mM Sorbitol (HY-B0400) 处理 5 min，确认染料标记细胞膜而非细胞壁。
4. 荧光检测：使用共聚焦显微镜 (Leica SP5)，488 nm 激光激发，双通道采集：绿色通道 500-580 nm，红色通道 620-750 nm。 5. GP 值计算：用 ImageJ 宏程序处理图像。

二、A549 细胞膜张力响应检测^[2]
步骤：
1. 细胞培养：A549 细胞培养至汇合或非汇合状态，胰酶 (HY-B2118) 消化后铺于玻璃底培养皿。
2. 渗透压处理：
高渗：加入含 100 mM 蔗糖的培养基孵育10分钟；
低渗：轻度低渗 (25% 1 mM CaCl₂+75% 培养基) 或重度低渗 (50% 1 mM CaCl₂ + 50% 培养基) 处理 10 分钟。
3. 染色操作：加入 1-5 μM Di-4-ANEPPDHQ，室温孵育 1-30 分钟 (短时标记细胞膜，长时可见内体)。
4. 荧光检测：激发波长 488 nm，发射通道为 500-580 nm 和 620-750 nm，使用 Zeiss 780 显微镜采集光谱图像。
5. 数据分析：通过 GP 值变化分析脂质堆积，低渗处理后 GP 值降低提示脂质排列松散。

三、脂质体 (Liposomes) 与巨质膜囊泡 (GPMVs)^[3]
步骤：
1. 脂质体制备：
POPC 与胆固醇按比例溶于氯仿，氮气流下蒸发成膜，真空干燥过夜；
加入 HEPES 缓冲液 (10 mM HEPES (HY-D0857)，150 mM NaCl, pH 7.0) 水化 30 分钟，涡旋后经 100 nm 聚碳酸酯膜挤出，脂质浓度 0.5 mM。
2. 染料掺入：Di-4-ANEPPDHQ (水溶液) 按 1:100 摩尔比加入水化后的脂质体，终浓度约 10 μM。
3. GPMVs 制备：RBL-2H3 细胞用 25 mM 多聚甲醛 (HY-Y0333)+10 mM DTT (HY-15917) 于 37°C 处理 1 小时，收集后用 250 nM Di-4-ANEPPDHQ 染色 30 分钟。
4. 光谱检测：
稳态光谱：Fluorolog-3 光谱仪，488 nm 激发，发射范围 500-700 nm；
时间分辨光谱 (TRES)：470 nm 脉冲激光激发，检测 540-700 nm 发射，分析荧光衰减动力学。

MCE has not independently confirmed the accuracy of these methods. They are for reference only.

665.54

C₃₂H₄₇Br₂N₃O₂

797785-10-5

液体

Purple to purplish red

Room temperature in continental US; may vary elsewhere.

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• [1]. Xiaoyu Zhao, et al. Di-4-ANEPPDHQ, a fluorescent probe for the visualisation of membrane microdomains in living Arabidopsis thaliana cells. Plant Physiol Biochem. 2015 Feb;87:53-60.  [Content Brief]

  [2]. Li N, et al. Di-4-ANEPPDHQ probes the response of lipid packing to the membrane tension change in living cells[J]. Chinese Chemical Letters, 2022, 33(3): 1377-1380.

  [3]. Amaro M, et al. Laurdan and Di-4-ANEPPDHQ probe different properties of the membrane. J Phys D Appl Phys. 2017 Apr 5;50(13):134004.  [Content Brief]