干货分享 | TSA 多重免疫组化: 如何进行实验设计及方案优化?

图 1. TSA 原理^[1]。 

图 2. TSA 实验步骤^[2]。

基于以上的优点，TSA 技术是研究复杂样本如细胞 (群)-细胞 (群) 之间的关系，疾病异质性，表征驱动疾病的系统生物学机制是非常重要的工具。

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TSA：实验设计

 

TSA 荧光染料亮度和稳定性，一般选择亮度高的染料搭配待检组织中低表达的靶标，选择亮度低的染料搭配待检组织中高表达的靶标。受抗体去除步骤影响最小的 TSA 荧光染料可安排在较前的轮次，而受抗体去除步骤影响最大的 TSA 荧光染料可安排在较后的轮次。

VF 系列的 TSA 染料热稳定性都比较好，对于染色强度，VF 780 会相对弱一点，建议染色的时间可以稍延长到 10-15 min，VF 480 容易有组织自发光干扰 (跟组织状态有关)，且不建议放最后一轮染色，VF 520，VF 570，VF 620 以及 VF 690 都比较强，对于染色顺序没有要求。

靶标在待检测组织中的丰度可以通过查阅文献，或者在 Human Protein Atlas 数据库中获得，或者通过预实验 (常规组化) 来确定。

三、靶标轮次的确定

表 2. 靶标轮次确定的预实验设计。

将实验组 N 与实验组一进行对比，如果实验组 N 与实验组一差异非常大的话，则将靶标放在第 N 轮不合适，如果实验组 N 与实验组一差异不大的话，则将靶标放在第 N 轮是合适的。

• 总结：为了平衡待测组织中靶点丰度和各通道信号亮度，尽量做到：强弱搭配，即高丰度的靶点搭配弱光，低丰度的搭配强光。

四、在对同一个细胞群进行多个 Marker 共染的时候，尽量避免过度活化的酪胺沉积导致的占位效应和/或酪氨酸耗竭。

五、避免因相没有平衡好邻光谱的 TSA 荧光染料信号而造成的信号串色。

表 3. TSA 染料激发和发射信息。

此外，如果荧光设备没有办法很好区分的话可以通过“强弱搭配”来减少串色，或者利用 inForm 软件进行光补偿调节。

六、确保循环染色过程中上一轮的染色抗体是完全变性去除的。

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