什么是受体结合分析？

体结合分析nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;一、直接的细胞表面受体结合在4℃下脂蛋白与LDL受体结合,nbsp;但脂蛋白受体复合物尚未内在化(internalized),脂蛋白与LDL受体处于平衡状态,因而可进行平衡结合研究。此项研究的数据可用Scatchard分析来测定脂蛋白与LDL受体的亲合力及每个细胞受体结合脂蛋白的量。所用脂蛋白浓度取决于平衡解离常数(Kd),nbsp;应采用大致与Kd数值相等的浓度。以下是常用的放射标记脂蛋白浓度范围:nbsp;人类LDL,nbsp;0.25-12ug/ml;nbsp;人类III型β-极低密度脂蛋白(β-VLDL),nbsp;0.2-10ug/ml;nbsp;狗Aponbsp;Enbsp;HDLC,nbsp;0.01-1.2ug/ml;nbsp;狗β-VLDL,0.54-4ug/ml;nbsp;及Aponbsp;E-双十二酰磷酸胆碱(DMPC)复合物,nbsp;0.005-1.0ug/ml。(所有浓度基于Lowry等人的蛋白测定法)————————————————————————————nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;方案4:nbsp;用于研究125I-标记脂蛋白与完整细胞表面LDL受体平衡结合的方法nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;(1).nbsp;实验前,nbsp;将带细胞的培养皿置一大盒冰上的金属托盘上预冷10-15分钟。nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;(2).nbsp;在15ml塑料锥形管内制备并在冰上预冷15分钟后的脂蛋白溶液组成是:DMEM-Hepes-LPDS[N-2羟乙基哌嗪-N‘-2磺酸乙烷(Hepes),nbsp;(代替重碳酸盐)pH7.4缓冲的DMEM,nbsp;含10%LPDS]。它含有为双份培养皿准备的6-12种不同浓度的125I-标记脂蛋白。每种浓度的125-I标记脂蛋白的第三块培养皿内的溶液通过加入20-100倍过量非标记配体来测定非特异结合。nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;(3).nbsp;当细胞培养皿在冰上时,nbsp;弃去细胞培养基,nbsp;用含放射标记脂蛋白的培养基替代。可采用在16mm皿内加0.25ml,nbsp;22mm皿内加0.45ml,nbsp;35mm皿内加0.95ml,nbsp;60mm皿内加1.9ml。从每管中取两份(每份20ul)测放射活性,nbsp;他们用于Scatchard分析法的计算及确定有放射活性脂蛋白的浓度。在冰上孵育并轻摇冷浴中的细胞3-5小时。(4℃下多数脂蛋白的受体结合在5-6小时内达到平衡,nbsp;但对多数情况而言,nbsp;孵育3-4小时足以达到平衡)。nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;(4).nbsp;孵育终止时,nbsp;仍置细胞于冰上,弃去培养基,用冷的PBS-BSA(每mlPBS含2mgnbsp;BSA)洗涤单层细胞三次。继之用相同缓冲液孵育10分钟,nbsp;并用冷PBS快速洗涤,nbsp;先后重复两次。洗涤细胞时,nbsp;用与重复分配器相连的长管进行。洗涤液沿孔壁流下,nbsp;覆盖所用细胞。细胞与培养皿的附着力差别很大,nbsp;所以对一些培养物必须十分小心。nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;(5).nbsp;将细胞从冰上移开,nbsp;用重复分配器(加样器)在每孔中加入0.1Mnbsp;NaOHnbsp;0.5ml,nbsp;用手轻摇平皿,nbsp;以确保整个平皿都被NaOH覆盖。封盖,nbsp;在室温下孵育10分钟使细胞溶解。nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;(6).nbsp;将已溶细胞移入12×75mm管内,nbsp;用0.5mlnbsp;NaOH洗各孔一次,nbsp;将洗液倒入管内。nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;(7).nbsp;塞好试管,nbsp;在r-计数仪上进行125I计数。现在多数计数器可进行重复实验平均取值,nbsp;消除背景以及计算100%对照的百分比,nbsp;这可节省手工计算的时间。nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;(8).nbsp;在测定蛋白浓度之前将试管置4℃保存,nbsp;可使用根据Techniconnbsp;Lowry方案设计的Technicon自动分析II型仪,nbsp;用BSA作标准。此自动分析仪直接从12×75mm原管中自动取样。当采用的是单层细胞且属接触抑制(如成纤维细胞)或为接近汇合时,每孔中的细胞蛋白几乎完全一样,nbsp;因而只需进行抽样测定。但当使用非接触抑制细胞(如平滑肌细胞)或在培养中有不分化的细胞(如巨噬细胞)时,nbsp;因各孔之间变化大而需逐管分析。nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;(一)、Scatchard分析nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;平衡结合研究得来的数据可通过Scatchard分析进行线性化。根据这一分析可确定125I-标记配基与受体结合的亲合力常数(Kd)和受体饱和时受体结合脂蛋白的数量。通过在X轴上标出“毫微克结合量(B)及在Y轴上标绘结合/游离比(B/F),如果在平衡时配基与受体均为纯体,nbsp;并且呈简单的双分子反应(如LDL与LDL受体的平衡结合),nbsp;那么就可得到一条直线。现有一种用于称为Scatdata的IBMPC的