第一个被设计用于光活化研究的光学指示剂是一种Aequorea victoria水母的蛋白突变体,叫做PA-G湖第少斯整第宣足农FP(分别取photo和activatable的首字母)。这种GFP蛋白的光活化突变体是将野生型中性蛋白质改造为阴离子态得来的。在稳定功在同服杂注状态(unpertu意输苗般界还烟背请乐rbed state)时,野属致好细句味收防免问以生型绿色荧光蛋白在395和475nm处分别有一大一小两个吸收峰。当用强紫外或紫光照射该蛋白时,发色团产生光转化,从而改变了大小两个吸收峰的相对消光系数的比值。结果是在488nm激发下,发射荧光的强度比未刺激前增加了3普交别唱工接倍。
由上至下分别为FRAP、FLIP、光活化。
通过突变技术的PA-GFP降低断觉张别封续朝真了475nm处的吸收峰,在450~550nm处的吸收几乎可以忽略不计,同时增强近紫外(约400nm)照射下野生型光转化效角率。因此极大增加了非活化和发占直引活化状态之间的反差。光活化后,PA-GFP在504n宗斯无三m处的最大吸收增误滑附客投送加了约100倍。这一现象极大增强了转化和未转化PA-GFP之间的差异,以此可以最终观察其在细胞内的动态变化。
显示了光活化前后的PA-GFP吸收和发射峰曲线。图中标明了用于光转化的激光波长(箭头所示)和宽场弧稳示击措侵联需光灯激发波段(黄色框)。图3a讨布带述究中的活化后荧光发射曲线是在488nm激光激发下得到的。用405nm固科倍体激光器可以激发目的位点,如图3b所示。光活化后,绿色发射荧光的强度会明显上升,如图3c所示。
PA-GFP的光活化可以用来标记粉亲村初的审代开居比选定分子或整个细胞,并利用延时图像技术获取动力学特征。在理想状态下,只有活化的PA-GFP分子发射醒目的荧光,新合成的蛋白不会对实验造成影响。PA-GFP的光活化会比利用GFP进行光漂白研究的速度更快、现象更明显,而且用于光活化的激光见细赵念待位强度要远小于FRAP的漂白激光,对细胞的杀伤相对较低。因此该项技术非常适合活细胞中蛋白质的动态研究。
但需要注意的是在光转化后,PA-GFP和野生型GFP荧光在488nm激发下都会表现同样水平的增强。但从另一方面讲,在未被光诱导(如405nm激发)前很难区分细胞是否表达PA-GFP,所征奏搞波手式图析低以用显微镜很难提前确定确切的表达区域。
