急求间接免疫荧光双染实验步骤

FITC：

操作步骤

将纯化的IgG抗体对PH9～9.5碳酸盐缓冲液透析过夜，
　　　　透析后抗体液移入小烧杯中

　　　　　　　　　　　　　　↓

　　　　称取适量IFTC，加入二甲亚砜(DMSO)(FITC～1mg/1ml DMSO)
　　　　使终浓度为1mgFITC／1mlDMSO
　　　　FITC／IgG比例:如IgG浓度为1mg／ml，FITC／IgG比例约为50μgFITC／mgIgG；
　　　　如IgG为5～10mg／ml，则比例为25μgFITC／ml IgG
　　　　在10ml小烧杯中先放入抗体

　　　　　　　　　　　　　　↓

　　　　按上述比例将FITC-DMSO溶液逐滴加入透析后的抗体溶液中

　　　　　　　　　　 　↓

　　　　将标记物用PBS加至2.5ml，磁力搅拌器室温下避光搅拌2h

　　　　　　　　　　　 ↓

　　　　用PD10柱(Sephadex G25柱)除去游离荧光素，先用25ml PBS淋洗G25柱

　　　　　　　　　　　 ↓

　　　　收集PBS洗脱第一个荧光素结合蛋白峰，测定F／P
　　　　比值。第二个荧光素峰为游离荧光素

　　　　计算:

　　　　　　　　　2.87×A495
　　　　F／P＝————————
　　　　　　　　A280-0.35×A495

　　　　合适的F／P值为2～4。

　
　注意事项：
1.　FITC保存于4℃暗处，使用前待试剂瓶升至室温时开盖称取，以避免潮解。
2.　FITC-DMSO液要临用时配制。
3. 碳酸盐缓冲液要新鲜配制。