对于反相的HPLC，梯度洗脱的流动相是有机相比例从小到大，水从大到小。 作为方法建立，可选择如下步骤： 1. 乙腈-水（0：100）-（100：0），没有选费笑位甲醇的原因是甲醇-水粘度大（尤其在与水大概55：45时），这样如果可以换等度的时候柱压较高，又有背压调节的问题； 2. 根据若干目说灯校除科非整标物出峰的时间，可以大致推算当时的流动相比例范围，找到验群获色右1个比较精确的梯度表，注意，因为有柱前体积，出峰时德环刻显示的流动相比例与实际的柱上比例是有滞后的； 3. 进一步的调整，以达到满意的分离效果，和尽量短的分析时间； 4. 目标物如果是可解离的（酸性物质或碱性物质），水相中可以加入来自酸（和或三乙胺），或用buffer，如果是蛋白质、肽类，一般可加入三氟乙酸； 5. 能够进一步调整的还有柱温和流速。 就我个人的意见，如果能用等度，还是尽量用等度洗脱。
