毕赤酵母提高表达量的策略

毕赤酵母高效表达策略概述
1.基因内特性
主要包括mRNA 5’端非翻译区(5’2 U TR)、基因A +T 组成和密码子使用频率3 方面由于巴斯德毕赤酵母乙醇氧化酶表达量极高(占胞内溶蛋白30% 上) 因此了有高蛋白表达量,维持外源基因mRNA 5’-U TR尽能和AOXlmRNA 5’-U TR 相似必需, 好保持两者致A + T 含量高基因巴斯德毕赤酵母表达时偶尔会造成转录提前终止,因A T 丰富区能存转录提前终止信号因此对A T 含量丰富基因好重新设计序列, 使其A + T 含量30%~ 55% 范围内
巴斯德毕赤酵母也有特殊密码子偏好趋向(赵翔,霍克克,李育阳. 毕赤酵母密码子用法分析[J ] . 生物工程学报,2000 ,16(3) :308 - 311.)
外源蛋白自身理化特点也影响其表达和分泌外源蛋白加工修饰都会影响蛋白表达量
2.选择强启动子
启动子转录水平上调控基因表达常用启动子AOXI 启动子PGAG(三磷酸甘油醛脱氢酶启动子) 近巴斯德毕赤酵母克隆组成型启动子,控制下β- LabZ 基因表达率比甲醇诱导下PAOX驱动产量更高,由于该组成型启动子需要甲醇诱导,发酵工艺应该更简单,同时其产量更高,所成代替PAOX1 有潜力启动子
通过分离选择恢复利用甲醇能力自发突变体, 从AOX1 基因缺陷菌株分离M ut+ 自发突变体从筛选提高表达量突变体(戴秀玉, 王恂, 周坚1 毕赤氏酵母PAOX2 突变化序列分析〔J 〕1微生物学报, 1999, 39 (6) : 559~ 5611)
3.增加外源基因整合拷贝数
(1)Invitrogen 公司新发展质粒pPIC9K上带有G418 抗性基因,通过转化子对G418抗性水平快速筛选高拷贝转化子(配合电激法转化效更好)
(2)体外载体上多次插入目基因片段
(3)载体目基因两端连上来自宿主或其非必需高重复基因片段, 通过同源重组而达高拷贝整合目(聂东宋, 梁宋平, 李敏1 外源蛋白巴氏毕赤酵母高效表达策略〔J〕1 吉首大学学报(自科学版) , 2001, 22 (3) : 40~ 41)
4.载体和宿主选择
KM71转化子muts 表型,而GS115 转化子主要mut + 表型,也有小部分muts 表型哪种表型对外源蛋白表达量更高,对每种蛋白而言确定信号肽也影响分泌表达水平重要因素α- 交配因子和目基因之间插入间隔肽(spacer peptide) 提高外源蛋白表达水平(王燕,梁镇和,张友尚,等. 人胰岛素甲醇酵母Pichiapa storis 分泌表达[J ] . 生物化学与生物物理学报,1999 :31(5) :587 - 589.)
5.优化发酵条件
发酵条件主要包括通气量、温度、pH、甲醇含量和培养时间等
5.1通气量影响表达水平极重要因素
用发酵罐进行培养,外源蛋白表达水平要比普通摇瓶发酵高出10~100 倍.主要原因普通摇瓶发酵通气理想,影响了菌体高密度生长及表达许多文献报道表达水平都摇瓶发酵条件下结,推测,用发酵罐进行培养,表达水平还会有上升空间
5.2碳源也影响高水平表达重要因素
毕赤酵母表达培养基常用碳源甘油, 甘油对AOX 启动子有抑制作用山梨糖醇代替甘油作碳源, 结生物质量下降, 外源蛋白表达有所提高
5.3培养基组成
目前主要有BM GY、FBS 2 种培养基用于培养P. pastoris由于BM GY 既含有磷酸缓冲液又含蛋白胨和酵母提取物, 因而菌株生长更好, 大大增加了生物量, 使表达量也相应大大提高
5.4甲醇诱导方式、用量、诱导时间
诱导方式:两步法(先用甘油培养使细胞达定浓度,再加甲醇诱导) 和联合生长培养方法(growth - associated ,早期加入甲醇诱导) 来诱导外源蛋白表达都有成功报道现般两步法来诱导外源蛋白表达用两步法来诱导外源蛋白表达,则诱导时起始pH 能毕赤酵母高效表达重组蛋白关键之,通过改变诱导时pH 值,使表达量提高50 %上(邱荣德,朱建蓓,王垒,等. 人p53 蛋白巴斯德毕赤酵母表达[J ] . 生物工程学报,1999 ,15(4) :477 - 481.)
growth - associated 诱导甲醇酵母高水平表达外源基因好方法,比普通方法高出10 倍