由于葡萄糖苷键的成键方式分为α-型与β-型两种，因此，其所对应的葡萄糖苷酶分别被称为α-葡萄糖苷酶与β-葡萄糖苷酶。
根据CAZy的具体分类，α-葡萄糖苷酶主要分布于GH4、GH13、GH31、GH63、GH97以及GH122五个家族中；而β-葡萄糖苷酶主要分布于GH1、GH3、GH5、GH9、GH17、GH30、GH116等七个家族中。 大多数葡萄糖苷酶都是保留型葡萄糖苷酶，其催化机理通常都遵循“两步法”机制。
第一步：作为亲核基团的羧基负离子亲核进攻糖苷键上的异头碳，同时作为广义酸碱对的另一个催化羧基上的氢与糖苷键上的氧原子形成氢键，第一次形成含氧碳正离子样过渡态（Oxocarbenium-like transition state）。经过键的形成有断裂，糖基分子的异头碳构型发生第一次翻转，并与亲核羧基形成酯键，生成糖基-酶共价中间体，同时释放出一分子糖配基。
第二步：糖基受体分子的活性羟基氢与发生解离的广义酸碱对羧基离子相互作用，同时受体分子的活性羟基氧亲核进攻糖基-酶共价中间体中糖基分子的异头碳，再次形成含氧碳正离子样过渡态，最终使得异头碳构型发生第二次翻转，并与受体羟基氧形成共价键，完成反应。 由于葡萄糖苷酶的催化机理，大多数葡萄糖苷酶都具有转糖苷活力。当受体分子为活性水分子时，酶表现出水解酶活力；当受体分子为带有羟基的非水分子时，酶表现出转糖苷活力。
