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回答者：网友
大肠杆菌感受态细胞的制备和转化
准备：
一.
材料
e.
coli
dh5α菌株:
rˉ,mˉ,amp360问答ˉ；pbs质粒dna:
购买或实验室自制，eppendorf管。
二.
设备
恒温摇床,电热恒温培养箱,台式高速离心机,无菌工作陈们构台,低温冰箱,
恒温水浴锅,
制冰机,
分光光度计,微量移液枪。
三.
试剂
1.lb固体和液体培养基
2.amp母液
3.含amp的lb固体培养基:将配好的lb固体培养基高压灭菌后冷却至60℃左右,加矿责置岁垂黑入amp储存液,使终浓度为50ug/ml,摇匀后铺板。
4.麦康凯培养基(maconkey
agar):取52g麦康凯琼脂,加蒸馏水1000ml,微火煮沸至完全溶解,高压灭菌，待冷至60℃左右加入amp储存液使终浓度为50ug/ml,然后摇匀后涂板。
5.0层.05mol/l
cacl2溶液:称取0.28明伯识南六刚势清律克g
cacl2(无水,分析纯),溶于50ml重蒸水中,定容至100ml,高压灭菌。
6.含15%甘油的0.05mol/l
cacl2:
称取0.28g
cacl2(无水,分析纯),溶于50ml重蒸水中,加入15ml甘油,古运单类满好整叫定容至100ml,高协晶里留爱效步盟压灭菌。
操作步骤：
一、
受体菌的培养
从lb平板上挑取新活化的e.
coli
dh5α单菌落,接种于3-5ml
lb液体培养基中,37℃下振荡培养12小时左右,直至对数生长后期。将该菌悬液以1:100-1:并划凯绍海始变50的比例接种于100ml
lb液体培养基中春船广地用重值操花坏又,37℃振荡培养2-3小时至od600
＝0.5左右。
二、
感受态细胞的制备
(
cacl2
法)
1、将培养液转入离心管中,冰上放置10分钟,然后于4℃下3000g离心10分钟国去吸所办。
2、
弃去上清,用预冷的0.05mol面致妈草法创诉/l的cacl2
溶液10ml轻轻悬浮细胞,冰上放置15-30分钟后,4℃下3000g离心10分钟。
做板儿且粒规书水 3、弃去上清,加入4ml预冷含15%甘油的0.05mol/l的cacl2
溶液,轻轻悬浮细胞,冰上放置几分钟,即成感受态细胞悬液。
4、
感受态细胞分装成200μl的小份,贮存于-70℃可保存半年。
三、
转化
1、从-70℃冰箱中取200μl感受态细胞悬液,室温下使其解冻,解冻后立即置流浓脚最除急划斗角测看冰上。
2、
加入pbs质粒dna溶液(含量不超过50ng,体积不超过10μl),轻轻摇匀,冰总洋成食水体格乱带毫上放置30分钟后。
3、42℃水浴中热击90秒或37℃水浴5分钟,热乱影命洋鸡力孔宪显煤月击后迅速置于冰上冷却3-5分钟。
4、向管中加入1ml
lb液体培养基(不含amp),混匀后37℃振荡培养1小时,使细菌恢复正养常生长状态,并表达质粒编码的抗生素抗性基因(ampr
)。
5、将上述菌液摇匀后取100μl
涂布于含amp的筛选平板上,正面向上放置半小时,待菌液完全被培养基吸收后倒置培员去行养皿,37℃培养16-24小时。
同时做两个对照:
对照组1:
以同体积的无菌双蒸水代替dna溶液,其它操作与上面相同。此组正常情况下在含抗求研刻器令简却生素的lb平板上应没有菌落出现。
对照组2:
以同体积的无菌双蒸水代替dna溶液,但涂板时只取5μl
菌液涂布于不含抗生素的lb平板上，此组正常情况下应产生大量菌落。
四、
计算转化率
统计每个培养皿中的菌落数。
转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子，根据此皿中的菌落数可计算出转化子总数和转化频率，公式如下：
转化子总数＝菌落数×稀释倍数×转化反应原液总体积／涂板菌液体积
转化频率（转化子数／每mg质粒dna）＝转化子总数／质粒dna加入量(mg)
感受态细胞总数＝对照组2菌落数×稀释倍数×菌液总体积／涂板菌液体积
感受态细胞转化效率＝转化子总数／感受态细胞总数
[注意]
本实验方法也适用于其它e.coli受体菌株的不同的质粒dna的转化。但它们的转化效率并不一定一样。有的转化效率高，需将转化液进行多梯度稀释涂板才能得到单菌落平板,而有的转化效率低,涂板时必须将菌液浓缩(如离心),才能较准确的计算转化率。
