1.1 实验动物与试剂
人HepG-2肝癌细胞（购自上海复祥生物科技有限公司），胰蛋白酶、DMEM无血清培养基和胎牛血清（购自美国Gibco公司），青霉素和链霉素（购自上海生物工程有限公司），CCK-8检测试剂盒、APC-AnnexinV细胞凋亡试剂盒和蛋白提取试剂盒（购自南京凯基生物科技发展有限公司），鼠抗人单克隆PDCD5抗体、鼠抗人单克隆Caspase-3抗体（购自美国Acom公司），辣根过氧化物酶（horseradishperoxidase，HRP）标记山羊抗鼠IgG（购自美国Sigma公司），兔抗鼠β-actin单克隆抗体（购自美国SantaCruz公司）。蛋白电泳仪为美国Bio-Rad公司产品。PDCD5-Caspase-3融合基因合成及转染用慢病毒均由上海吉凯基因公司提供。
1.2 PDCD 5- Caspase -3融合基因构建及慢病毒包装
利用PubMed基因数据库查询PDCD5和Caspase-3基因CDS序列，设计相应融合基因序列，PCR扩增PDCD5-Caspase-3融合基因片段，将目的融合基因克隆到慢病毒GV358中，引物序列：正向5'-CCATCAGAGAGAAAACCGAAC-3'，反向5'-CCTCTTATAGTCCACTTATGTC-3'，PCR反应条件为：94℃预变性3min ；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共循环40次，72℃延伸5min，最后取适量菌液进行测序，测序结果与目的基因序列进行比对分析，测序结果与与目标序列完全一致。抽提Ubi-PDCD5-Caspase-3-SV40-EGFP质粒，采用二代自失活型慢病毒包装系统完成包装过程，将携带 PDCD5-Caspase-3融合基因的GV358载体质粒、包装质粒pHelper1.0和pHelper2.0共转染239T细胞，转染48h后，高速离心收集含慢病毒颗粒的239T细胞上清液，置于-80℃冰箱冷冻保存备用。
1.3 HepG-2肝癌细胞转染HepG-2
肝癌细胞株活性强，增殖旺盛，2～3d即可传代1次，待培养细胞贴壁生长至培养瓶的80%～90%时，0.25%胰蛋白酶消化，离心收集，含10%DMEM培养基重悬，按照3×105个/ml种植24孔板中，每孔400μl。按照吉凯公司推荐的HepG-2肝癌细胞最佳转染复数为100，设置3组 ：①实验组（5μg/mlPolybrene+50μlUbi-PDCD5-Caspase-3-SV40-EGFP病毒上清液）；②对照组（5μg/mlPolybrene+50μl阴性对照病毒上清液）；③空白组（不加病毒上清液）；37℃培养箱中孵育12h后换液，继续培养。由于质粒中含有EGFP基因，本研究利用荧光显微镜和流式细胞仪检测实验组转染效率。
1.4 Western blot检测PDCD5和Caspase-3蛋白表达
转染细胞48h后，离心收集5×105个各组细胞，PBS清洗3次，蛋白裂解液提取细胞蛋白，BCA法测定样品中总蛋白浓度，蛋白变性，SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，PVDF转膜80V2h，5%脱脂奶粉封闭lh，剪膜，加入1∶300稀释鼠抗人单克隆PDCD5抗体（一抗）和1∶500鼠抗人单克隆Caspase-3抗体（一抗），4℃孵育过夜，加入1∶400HRP标记二抗室温孵育30min，1∶1000稀释β-Actin作为内参，在ECL显色系统中显色定影，AlphaEaseFC软件分析显色的杂交条带。
1.5 CCK-8 检测细胞增殖
HepG-2肝癌细胞转染后，以1×10^5个/ml种植96 孔板，每孔100μl，每组9孔，在转染24、48 和72h，各组均分别选取3孔检测细胞增殖情况，每孔加入CCK-8试剂10μl，37℃，5%二氧化碳细胞培养箱中培养2h，酶联免疫监测仪检测各孔吸光度（A）值，波长450nm，参比波长为630nm。每孔复测3次，取结果平均值行统计分析。
1.6 流式细胞仪检测细胞凋亡
按照APC-AnnexinV细胞凋亡试剂盒说明书操作，细胞转染72h后，PBS清洗2遍，胰酶消化，离心收集细胞，每管收集2×10^5个细胞，加入500μl的BindingBuffer悬浮细胞，分别加入5μlAnnexinV-APC和5μlPropidiumIodide混匀，室温避光反应30min，流式细胞仪检测各组细胞凋亡率。
1.7 统计学方法
数据分析采用SPSS17.0统计软件，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，比较采用方差分析，两两比较，方差齐性用LSD- t检验，方差不齐用Dunnett'sT3法， P<0.05 为差异有统计学意义。