2.1 生产用细胞 生产用细胞为人二倍体细胞。 2.1.1 细胞库管理及检定应符合“生物制品生产用动物细胞基质制备及检定规程”规定乡二。 取自同批工作细胞库的1支或多支细胞管，经复苏扩增后的细胞仅用于一批疫苗的生产。 主细胞库细胞世代应控制在第23代以内，工作细胞库细胞世代应控制在第27代以内，生产用细胞世代应控制在第44代以内。 2.1.2细胞制备 从工作细胞库之细胞种子开始培养，连续传代，至足够数量的细胞培养物。长成单层的细胞用0.25%胰蛋白酶消化，分散均匀后以适宜的分种率传代，于谁侵越机首展37℃贴壁静置或旋转培养。 2.2 毒种 2.2.1 名称及来源 生产用毒种为脊髓灰诗战然许裂帮组裂坐质炎病毒I、Ⅱ、脚婷宪衣慢滑汽如染弦Ⅲ型减毒株；可用毫燃调范载北叫态I、Ⅱ、111型Sabin株，l、Ⅱ、Ⅲ型Sabin纯化株，中Ⅲ2株或经批准的其他响径单侵到取毒株。 2.2.2 种子批的建立 应符合“生物制品生产检定用菌毒种管理规程”规定。 送冷 2.2.2.1 原始种子批 Sabin株原始毒种I、Ⅱ、Ⅲ型及中Ⅲ2株均由毒种很队间研制者制备和保存。 2.2.2.2 主种子批 由原始毒种在胎猴肾或人二倍体细胞上传1～2代制粮切乙宪首成的成分均一的一批病毒悬液称为主种子批。 Sabin株主种子批的传代水平为SO十1；中Ⅲ2株主种子批的传代水平为中Ⅲ2 1代；Ⅲ型pfizer株主种子批为RSO1。 2.2单没阿厚确任.2.3 工作种子批 取主种子批毒种在人二倍体细胞上传l～2代制备的组成均一的一批病毒悬液称为工作种子批。 2.2.3 毒种传代 从原始种子批到工作种子展指越素左土批的传代次数，Sabin I型、SabinⅡ型和其他纯化株以及中Ⅲ2株不得超过3代；sabinⅢ型及其他纯化株包括pfizer株不得超过2代。 制备生产用种子批所用的细胞应限于眙猴肾或人二倍体细胞。 子组植挥计充车迫 2.2.4 种子批毒种的检定 除另有规定外，主种子批及工作种子批应进行以下全面检定。 死座乎封强初旧刚 2.2.4.1 鉴别试验 取适量I型、Ⅱ型或Ⅲ型单哪掉不标厂空准素现念叶价脊髓灰质炎病毒抗血清与适量病烟发降量毒供试品混合，置被损协解雨生各星击掉35～37℃中和1～2小时，接种Hep-2细胞或其他敏感细胞，置适宜温度(35～36℃)培养，7天判定结果，病毒型别应准确无误。同时设血清和细胞对照，均应为阴性。病毒对照应为阳性。 2.2.4.2 病毒滴定 采用微量细胞病变法。取毒种做10倍系列稀释，每稀释度病毒液接种Hep-2细胞或其他敏感细胞，置适宜温度(35～36℃)培养，7天判定结果。病毒滴度应不低于6.5 lg CCID〈[50]〉/ml。应同时进行病毒参考品滴定。 2.2.4.3 无菌检查 依法检查(附录ⅫA)，应符合规定。 2.2.4．支原体检查 依法检查(附录ⅫB)，应符合规定。 2.2.4.5 病毒外源因子检查 依法检查(附录ⅫC)，应符合规定。 2.2.4.6 家兔检查 取毒种进行此项检查。如不立即进行试验，毒种应保存于-20℃以下。取体重为1.5～2.5kg的健康家兔至少5只，每只注射10ml，其中1.0ml皮内多处注射，其余皮下注射，观察3周，到期存活动物数应不低于80%，无B病毒和其他病毒感染判为合格。家兔在24小时以后死亡，疑有B病毒感染者应尸检．须留神经组织和脏器标本待查，用脑组织做10%悬液，用同样方法接种5只健康家兔进行检查。 2.2.4.7 免疫原性检查 用工作种子批毒种制成原疫苗，按常规接种易感儿童(免前抗体效价<1：4)至少30名，分别于免疫前及免疫后4周采血，测定中和抗体，免疫后抗体阳转率应不低于95%。 2.2.4.8 猴体神经毒力试验 依法检查(附录ⅪL)，应符合规定。 2.2.4.9 rct特征试验 将单价病毒液分别于360℃± 0.1℃及400℃± 0.1℃进行病毒滴定，试验设t-对照(生产毒种或已知对人安全的疫苗)。如果病毒液和t-对照在36℃±O．1℃的病毒滴度与40℃±0.1℃的滴度差不低于5.0 1g，则rct特征试验合格。 2.2.4.10SV40核酸序列检查 依法检查(附录IX H)，应为阴性。 2.2.5 毒种保存 液体毒种需加入终浓度为lmol/L的氯化镁溶液，置-60℃以下保存。 2.3 原液 2.3.1 细胞制备 同2.1.2项。 2.3.2 培养液 细胞的培养液为含适量灭能小牛血清和乳蛋白水解物的MEM液或其他适宜培养液。小牛血清的质量应符合要求(附录ⅧD)。病毒维持液为不含小牛血清的MEM液或其他适宜维持液。 2.3.3 对照细胞病毒外源因子检查 依法检查(附录ⅫC)，应符合规定。 2.3.4 病毒接种和培养 毒种与细胞按一定比例接种。种毒后置33℃±0.5℃培养40～96小时至细胞出现完全病变后收获。 2.3.5 病毒收获 病毒液逐瓶澄清过滤，收集于大瓶中，即为单价原液。 2.3.6 原液合并或浓缩 原液可合并或浓缩。 2.3.7 原液检定 按3.1项进行。 2.4 半成品 2.4.1 配制 单价原液加入氯化镁，其终浓度为1mol/L，即为单价疫苗半成品。取适量I、Ⅱ、Ⅲ型单价疫苗半成品，按一定比例进行配制，即为三价疫苗半成品。 2.4.2 半成品检定 按3.2项进行。 2.5 成品 2.5.1 疫苗糖丸制备 三价疫苗半成品及赋形剂按一定比例混合后制成糖丸。滚制糖丸时，操作室内温度应在18℃以下。 2.5.2 分批 应符合“生物制品分批规程”规定。同一次混合的三价疫苗半成品制备的糖丸为一批，非同容器滚制的糖丸分为不同亚批。 2.5.3 分装 应符合“生物制品分装和冻干规程”规定。 2.5.4 规格 每粒1g。每1次人用剂量1粒，含脊髓灰质炎活病毒总量应不低于5.95 lg CCID〈[50]〉，其中I型应不低于5.81g CCID〈[50]〉，Ⅱ型应不低于4.8 Ig CCID〈[50]〉，Ⅲ型应不低于5.3 lg CCID〈[50]〉。 2.5.5 包装 应符合“生物制品包装规程”规定。
