病理学检验技术

冰冻切片

免疫组织化染色用种切片其突优点能够较完保存种抗原免疫性尤其细胞表面抗原更应 采用冰冻切片新鲜组织及已固定组织均作冰冻切片

冰冻组织水份易形冰晶往往影响抗原定位般认冰晶少影响较冰晶组织结构损害较含水量较组织述现象更易发冰晶与其速率比与核率（形速率）反比即冰晶形数量愈则愈组织结构影响愈严重应尽量降低冰晶数量Fish认冰冻始冰晶核率较慢逐渐增加其临界温度-33C, -30C降至-43C间核率急剧增加达1018再减慢基于述理论采取措施减少冰晶形

（1）速冻使组织温度骤降缩短-33C43C间减少冰晶形其二：

①干冰-丙酮（酒精）：150-200ml丙酮（酒精）装入保温杯内逐渐加入干冰直至饱呈粘稠状再加干冰再昌泡温度达-70℃C用烧杯（50-100ml）内装异戊烷约50ml再烧杯缓慢置入干冰丙酮（纯酒精）饱液内至异戊烷温度达-70℃即使用组织（1cm×0.8cm×0.5cm）投入异戊烷内速冻30-60s取或置恒冷箱内备切片或置-80℃低温冰箱内贮存

②液氮：组织块平放于软塑瓶盖或特制盒内（直径约2cm）组织块适量加OCT包埋剂浸没组织特制盒缓缓平放入盛液氮杯内盒底部接触液氮 即始气化沸腾盒保持原位切勿浸入液氮约10-20s组织即迅速冰结块取组织冰块立即置入-80℃冰箱贮存备用或置入恒冷箱切片机冰冻切片

（2）组织置于20%-30%蔗糖溶液1～3利用高渗吸收组织水减少组织含水量

影响冰冻切片素较技术难度较选择冰冻切片机保证切片质量关键目前冰冻切片机两类：

①恒慢冰冻切片机（Cryastat）：较理想冰冻切片机型号其基本结构切片机置于-30℃C低温密闭室内故切片受外界温度环境影响连续切薄片至2-4μm完全能满足免疫组织化标记要求切片低温室内温度-15℃～18℃宜温度低组织易破碎抗卷板位置及角度要适载玻片附贴组织切片切勿移

②放式冰冻切片机：包括半导体致冷切片机甲醇致冷切片及式CO2、氯乙烷等冷冻切片机切片暴露空气温度易控制切片技术难度 高温季节 切片更加困难且切片厚8～15μm易连续切片其优点价廉内产

冰冻切片染色必须吹干贮存低温冰箱内 或进行短暂预固定贮存冰箱保存

石蜡切片
其优点组织结构保存良病理顾性研究较实用价值能切连续薄片组织结构清晰抗原定位准确用于免疫组化技术石蜡切片制备与规制片略同：①脱水、透明等程应4℃C进行尽量减少组织抗原损失②组织块应限于2cm×1.5cm×0.2cm使组织充脱水、透明、浸蜡③浸蜡、包埋程石蜡应保持60℃溶点低软蜡（即低温石蜡包埋）

全程18-24h室温内使用自脱水机代替组织块 直径于0.5cm用快速石蜡包埋切片全程需4h左右

石蜡切片规制片技术切片机轮转式切片厚度2～7μm应用范围广影响抗体穿透性染色均匀致由于甲醛固定、机熔剂包埋剂组抗原定损害及遮蔽使抗原特征发改变报告经蛋白酶消化改善光镜免疫组化染色强度用胰蛋白酶、链霉蛋白酶及胃蛋白酶等消化石蜡切片应入37℃恒温箱夜烤片减少染色脱片现象切片需期贮存存放于4℃冰箱内备用

石蜡切片优点较制片程要经酒精、二甲苯等机溶剂处理组织内抗原性失较采用冷冻干燥包埋（Freeze drying embedding methed）保存组织内溶性物质防止蛋白变性酶失减少抗原丢失该新鲜组织低温速冻利用冷冻干燥机（Freezing dryer）真空、低温条件排除组织内水 用甲醛蒸气固定干燥组织组织浸蜡、包埋、切片用于免疫荧光标记、免疫酶标记及放射自显影

振切片
用振切片机（Vibratotme）新鲜组织（固定冰冻）切厚片20～100μm漂浮反应板进行免疫组织化染色解剖显微镜检免疫反应阳性部位修整组织进行固定按电镜品制备、脱水、包埋、超薄切片、染色观察等组织冰冻冰晶形组织抗原破坏免疫组化染色前避免组织脱水、透明、包埋等步骤抗原损害能较保留组织内脂溶性物质细胞膜抗原主要用于显示神经系统抗原布研究种包埋前染色尤其实用于免疫电镜观察

塑料切片
塑料包埋切片用包埋剂甲基丙烯酸盐类（Glycol methacrylate, GMA）及环氧树脂类（Epon 812,618）其优点同作光镜电镜检测能相互照所查抗原定位准确塑料包埋切片切比石蜡切片更薄切片光镜切片薄至0.5～2um故称半薄切片（Semithin section）GMA保存抗原较与组织产共聚合形态结构欠佳环氧树脂FponAraldite能较保存形态结构聚合程易组织起作用改变抗原结构塑料包埋切片由于处理程序繁抗原性易丢失同半薄切片进行免疫染色抗血清易穿透树脂塑料切片主要用于免疫电镜超微切片前定位包埋前染色标本切片薄切片需染色直接相差显微镜观察免疫反应部位呈黑点状定位进步作超薄切片明显提高免疫电镜阳性检率

超薄切片
电镜标本制作见第七章 应用超薄切片机（Ultrotome）进行切片

碳蜡切片
碳蜡（Carbowax）名聚乙烯二醇（Polyethlene glycol, PEG）水溶性蜡根据其量同碳蜡种400、800、1000、1500、4000、6000等用于组织包埋1500、4000两种其熔点别38℃C52C左右温固体石蜡状加温熔化呈液体状

本特点组织固定水洗需脱水透明直接浸蜡包埋且切片与规石蜡切片相同切组织片漂浮水面自展碳虹迅速深化组织片即展平制片程简单易行

具体操作简述：组织块宜般限定1.5cm×1cm×0.1cm内①组织固定充水洗除固定液用滤纸吸干组织表面水②组织浸入碳蜡（1500）内45℃30min③再浸入混合混合碳蜡液（15004000等量混合液）52℃ 30min④浸入等量混合碳蜡液（或根据气温、湿度变化调整40005000混合比例气温高湿度4000：1500=3：2混合反则2：3混合）⑤用等量混合碳蜡或调整混合碳蜡包埋组织蜡块⑥切片与石蜡切片相同操作程碳蜡组织块应尽量避免与水或冰接触贮存应密封干燥冷藏

本优点操作程序减少间缩短组织经机溶剂损害、温度低、抗原性保存比石蜡切片组织结构清晰缺点夏季室温高切片较困难连续切片石蜡切片顺利；由于碳蜡强吸湿性易期保存