介绍
2,2’-(1,2-乙二基双氧代)双乙硫醇又被称为3,6-二氧杂-1,8-辛二硫醇（3,6-dioxa-1,8-octanedithiol，DODT），可以作为无臭型硫醇清除剂，被广泛推荐替代乙二硫醇（EDT）用于Fmoc固相多肽合成（Fmoc-SPPS）的三氟乙酸（TFA）切割步骤，以抑制氨基酸残基烷基化、氧化等副反应。DODT在含甲硫氨酸多肽的切割中存在严重的特异性副反应。
图一 2,2’-(1,2-乙二基双氧代)双乙硫醇
甲硫氨酸烷基化副反应
以11条含甲硫氨酸多肽为模型，采用2,2’-(1,2-乙二基双氧代)双乙硫醇切割液进行TFA酸解后，LC-MS检测显示所有产物均出现+117Da主杂质，同时伴随少量+57Da叔丁基化杂质；部分多肽中+117Da杂质占比高达50%，且与目标肽共洗脱，常规反相高效液相色谱（RP-HPLC）无法有效分离。副反应为DODT与甲硫氨酸的特异性反应，与多肽合成路线无关。
通过短肽模型（GMTNY）分离纯化副产物，结合¹HNMR、¹³CNMR及二级质谱（MS/MS）解析，修饰位点为甲硫氨酸的硫醚硫原子，生成叔丁基乙硫醚锍盐衍生物；+117Da的质量增量对应叔丁基-乙硫醚基团，MS/MS碎片中57Da特征峰验证了叔丁基结构的存在。NMR数据显示，甲硫氨酸甲基氢化学位移从2.1ppm偏移至2.97ppm，碳信号从14.1ppm偏移至22.5ppm，直接证明硫原子的烷基化修饰；同时，手性锍盐的生成导致相邻碳信号裂分。
2,2’-(1,2-乙二基双氧代)双乙硫醇的醚氧键在TFA强酸性条件下发生环化，生成硫杂环丙烷或环状缩醛中间体，经开环反应与甲硫氨酸硫原子发生亲核烷基化，是副反应的核心路径。醚氧结构是反应发生的必要条件：无醚键的ODT仅产生常规叔丁基化杂质，无117Da衍生化产物；而丝氨酸、苏氨酸邻近甲硫氨酸虽会加剧副反应，但并非必要条件。
清除剂与氨基酸原料优化
含甲硫氨酸多肽优先选用EDT替代2,2’-(1,2-乙二基双氧代)双乙硫醇，或采用ODT作为无臭替代方案，二者均完全杜绝+117Da杂质；使用Fmoc-Met(O)替代甲硫氨酸，亚砜结构封闭硫原子亲核活性，切割后无需额外还原即可获得目标肽，是最彻底的规避方法。
合成后去除
2,2’-(1,2-乙二基双氧代)双乙硫醇修饰产物具有酸不稳定性，可通过后处理定量脱除：将粗肽溶于乙腈/水（1:1，v/v）含0.1%甲酸的溶液中，37℃保温12~14h，可完全转化为未修饰的目标肽，无多肽降解与残基异构化。该方法条件温和，优于传统高温乙酸处理，适配酸敏感多肽序列[1]。
图二 合成后去除
参考文献
[1]Harris P W R, Kowalczyk R, Yang S H, et al. An important side reaction using the thiol, 3,6‐dioxa‐1,8‐octanedithiol (DODT), in 9‐fluorenylmethoxycarbonylbased solid phase peptide synthesis[J]. Journal of Peptide Science, 2014, 20(3): 186-190. DOI:10.1002/psc.2595